王祖成，馬 香，李 宏，王 丹，唐鴻倩，唐燕瓊，劉 柱

（海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是一類桿狀的革蘭氏陰性菌，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，并廣泛存在于水環(huán)境中的常見致病菌。維氏氣單胞菌于1983年首次從病患機(jī)體中分離出來并命名[1]，此后該菌株不斷在魚類、水體環(huán)境以及食物中被分離鑒定出來，是一類重要的食源型致病菌[2]。維氏氣單胞菌對(duì)人、魚以及陸生哺乳動(dòng)物均具有極強(qiáng)的致病性。魚類感染維氏氣單胞菌后會(huì)使體表充血紅腫甚至潰爛、內(nèi)臟出血、腹水等癥狀[3-4]；人類感染維氏氣單胞菌后會(huì)引起嚴(yán)重的腸胃感染以及敗血癥，免疫力低下的人群甚至?xí)l(fā)更嚴(yán)重的腦膜炎以及尿路感染[5]；有案例表明維氏氣單胞菌可感染一些哺乳動(dòng)物，引發(fā)腸胃炎，并導(dǎo)致肝臟受損[6]。近年來，由維氏氣單胞菌引發(fā)的感染案例越來越多，這對(duì)魚類養(yǎng)殖業(yè)以及人類的生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。因此，解構(gòu)維氏氣單胞菌感染和致病機(jī)理將對(duì)維氏氣單胞菌的防治具有重要意義。

雙組分系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌中，通過感知外界信號(hào)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌內(nèi)基因的表達(dá)，幫助細(xì)菌快速適應(yīng)變化的環(huán)境。此外，有研究表明雙組分系統(tǒng)也與細(xì)菌致病性相關(guān)，熒光假單胞菌可通過RstA/RstB雙組分系統(tǒng)激活外排泵增加耐藥性[7]，野油菜黃單胞菌通過RavA/RavR雙組分系統(tǒng)調(diào)控鞭毛合成使其更容易侵染宿主[8]。FlrB/FlrC被鑒定為調(diào)控細(xì)菌鞭毛合成的雙組分系統(tǒng)[9]，F(xiàn)lrB作為傳感器激酶具有自磷酸化和傳遞磷酸基團(tuán)至受體調(diào)節(jié)器的作用，進(jìn)而調(diào)控下游鞭毛基因的表達(dá)，霍亂弧菌鞭毛合成受該雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)[10]。FlrB作為感受器激酶是雙組分系統(tǒng)中不可或缺的因子，對(duì)鞭毛系統(tǒng)的合成至關(guān)重要，并且鞭毛是細(xì)菌成分中影響生物膜形成的主要因子[11-12]。研究表明在溶藻弧菌中敲除flrB基因后細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成顯著降低[13]，在霍亂弧菌中FlrC的磷酸化依賴于同源FlrB，磷酸化的FlrC能提高細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和定植能力[14]。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)維氏氣單胞菌進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)FlrB/FlrC雙組分系統(tǒng)存在于維氏氣單胞菌中。雖然flrB基因被報(bào)道與致病性性狀相關(guān)，但在維氏氣單胞菌中的作用機(jī)理尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在構(gòu)建flrB基因敲除株，揭示維氏氣單胞菌中flrB基因的生物學(xué)作用，進(jìn)一步闡明維氏氣單胞菌的致病機(jī)理，為維氏氣單胞菌的治療和防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器維氏氣單胞C4菌株、大腸桿菌WM3064、pRE112質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室自存?；蚪M提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、產(chǎn)物純化回收試劑盒、2×PCR MIX購自諾維贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切為酶（KpnI、XbaI）以及T4連接酶購自NEB公司；氨芐青霉素（水溶，母液濃度50 g·L-1，工作濃度50 μg·mL-1，-20 ℃保存）、氯霉素（乙醇溶，母液濃度25 g·L-1，工作濃度25 μg·mL-1，-20 ℃保存）、二氨基庚二酸（水溶，母液濃度50 g·L-1，工作濃度50 μg·mL-1，-20 ℃保存）、LB培養(yǎng)基（1% NaCL、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物）購自索萊寶有限公司。PBS緩沖液（100 mmol·L-1NaCL，8.1 mmol·L-1Na2HPO4，1.5 mmol·L-1KH2PO4，2.7 mmol·L-1KCL，PH 7.4），結(jié)晶紫染料、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自海南正恒科技有限公司。Eppendorf Centrifuge 5418 高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf 中國(guó)有限公司）、Life ECO-PCR 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）、Bio-Rad MicroPulser 電穿孔儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）、HZQ-F100 振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司）、ME204E 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。本研究所用的flrB上下游同源臂擴(kuò)增引物、flrB敲除驗(yàn)證引物、pRE112載體驗(yàn)證引物均合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，序列見表1。

表1 基因敲除所用引物序列Tab. 1 Primer sequence for gene knockout

1.2 擴(kuò)增flrB基因上下游同源臂片段以細(xì)菌總DNA為模板，分別用flrB-F1/flrB-R1和flrB-F2/flrBR2 進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。30 μL PCR體系：2×PCR MIX 15 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O 12 μL，上下游同源臂引物各1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 S，58 ℃ 30 S，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 總延伸10 min 4 ℃停止反應(yīng)。使用產(chǎn)物純化試劑盒純化回收擴(kuò)增的DNA片段并保存于4 ℃冰箱待用，同時(shí)使 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶大小是否正確。

1.3 pRE112-ΔflrB載體構(gòu)建使用Overlap PCR連接上下游同源臂。Overlap PCR 體系（50 μL）：2×PCR MIX 25 μL，引物flrB-F1 1 μL，引物flrB-R2 1 μL，上游擴(kuò)增同源臂 1 μL，下游擴(kuò)增同源臂1 μL，ddH2O 21 μL；PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，95 ℃ 30 S，58 ℃ 30 S，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 總延伸10 min 4 ℃停止反應(yīng)?；厥誔CR產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，加入30 μL 6×DNA上樣緩沖液混勻并加入到1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V恒流電泳25 min。使用凝膠成像儀觀測(cè)并切膠回收正確條帶，使用產(chǎn)物純化試劑盒回收凝膠中的DNA片段并檢測(cè)濃度。以KpnI和XbaI酶切pRE112質(zhì)粒和上下游同源臂連接片段，酶切體系50 μL（5 μL Cutsmart mix，KpnI和XbaI各1 μL，pRE112質(zhì)粒和上下游同源臂連接片段1 500 ng，加水補(bǔ)齊至50 μL），37 ℃酶切4 h。用產(chǎn)物純化試劑盒純化回收酶切后產(chǎn)物。用T4連接酶進(jìn)行連接酶切后的質(zhì)粒與片段，連接摩爾比質(zhì)粒（片段為1∶5，連接體系為：1 μL T4連接酶，1 μL T4連接酶buffer，酶切pRE112質(zhì)粒100 ng，酶切片段50 ng，加水補(bǔ)齊至10 μL），16 ℃連接1 h。使用電擊轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌WM3064感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37 ℃孵育1 h后涂布于氯霉素、二氨 基庚二酸平板上過夜培養(yǎng)；挑取單菌落，使用pRE112引物進(jìn)行驗(yàn)證，成功重組載體送測(cè)序，作進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.4 雙親接合及敲除菌株篩選接種野生型維氏氣單胞菌C4和攜帶有pRE112-ΔflrB的大腸桿菌WM3064，分別于30 ℃和37 ℃過夜培養(yǎng)，以2×106CFU· mL-1為起始菌量轉(zhuǎn)接并培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6；將維氏氣單胞菌和大腸桿菌以（1∶1）、（1∶4）、（2∶3）、（3∶2）、（4∶1）的比例混合至1 mL，6 000 r·min-1離心3 min去上清，使用10 μL新鮮培養(yǎng)基重懸菌體并點(diǎn)于DAP平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以上。向培養(yǎng)后的接合平板上加1 mL新鮮培養(yǎng)基，用涂布棒刮下菌體于培養(yǎng)基中，取20 μL刮下的菌液稀釋10倍后涂布于氯霉素和氨芐青霉素雙抗平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取單菌落驗(yàn)證接合。挑選成功接合的單菌落接種于添加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜使其充分發(fā)生重組。取過夜培養(yǎng)的菌液依次稀釋10、20、30倍，取200 μL各稀釋梯度的菌液涂布于8%蔗糖和氨芐青霉素平板上，30 ℃恒溫倒置過夜培養(yǎng)。挑選生長(zhǎng)出的單菌落用F0/R0引物進(jìn)行P CR驗(yàn)證敲除菌株。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定挑取野生型和敲除flrB基因的單菌落接種過夜活化，以2×106CFU·mL-1起始菌量轉(zhuǎn)接至添加有氨芐青霉素的200 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，150 r·min-1，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每1 h取菌檢測(cè)OD值。每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)測(cè)量數(shù)據(jù)并繪制隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，觀察其生長(zhǎng)情況。

1.6 生物膜形成測(cè)定采用96孔板微量法檢測(cè)生物膜形成，挑取野生型和敲除flrB基因的單菌落接種于加氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中過夜活化，以2×106CFU·mL-1為起始菌量轉(zhuǎn)接至添加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，吸取200 μL菌液于無菌96孔板中置于30 ℃靜置培養(yǎng)36 h。吸出菌液并用PBS緩沖液清洗至澄清，常溫晾干96孔板，加入200 μL 1%結(jié)晶紫燃料在常溫下染色10 min，用無菌水清洗板孔至澄清狀態(tài)，55 ℃烘干96孔板，加入200 μL 33%冰乙酸于37 ℃下靜置30 min充分溶解附著的結(jié)晶紫染 料，酶標(biāo)儀檢測(cè)595 nm處吸光度值。每組樣品設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算差異性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad 6.02統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，(ANOVA)顯著性水平設(shè)定為P＜0.05[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pRE112-ΔflrB載體構(gòu)建使用維氏氣單胞菌C4基因組DNA為模板擴(kuò)增上下游同源片段，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增DNA大小與純度。由圖1-A可知，第1、2泳道分別為flrB基因上游同源臂片段、flrB基因下游同源臂片段，條帶單一明亮且大小正確，適合作為模板進(jìn)行Overlap PCR連接該上下游片段。將提取的pRE112質(zhì)粒和Overlap PCR連接的flrB基因上下游同源臂片段進(jìn)行雙酶切，純化回收酶切片段并連接過夜，通過電轉(zhuǎn)至大腸桿菌WM3064中并涂布于氯霉素和二氨基庚二酸平板上進(jìn)行篩選，使用pRE112載體引物進(jìn)行驗(yàn)證，以空載pRE112作為陰性對(duì)照。從圖1-B可知，泳道1～6條帶大小與陰性對(duì)照一致，說明未成功構(gòu)建，泳道7、8條帶單一且大小位于1 500～2 000 bp之間，大于陰性對(duì)照條帶，并且該條帶符合插入目的片段后應(yīng)具有的大小，說明7、8為成功連接載體，提取質(zhì)粒測(cè)序進(jìn)一步 驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pRE112-ΔflrB載體。

圖1 pRE112-ΔflrB載體構(gòu)建M：DL5000DNA Maker。A. flrB基因上下游同源臂擴(kuò)增結(jié)果（1：flrB基因上游同源臂擴(kuò)增；2：flrB基因下游同源臂擴(kuò)增）；B. pRE112-ΔflrB重組載體驗(yàn)證（1～9：使用載體引物驗(yàn)證pRE112-ΔflrB的擴(kuò)增片段；10：以空載體為模板的陰性對(duì)照）。Fig. 1 pRE112-ΔflrB vector constructionM: DL5000DNA Marker. A. flrB gene upstream and downstream homology arms amplification results (1: flrB gene upstream homology arm amplification; 2: flrB gene downstream homology arm amplification); B. pRE112-ΔflrB recombinant vector verification (1-9: Vector primers used to verify the amplified fragment of pRE112-ΔflrB; 10: Negative control with empty vector as template pRE112-ΔflrB).

2.2 雙親接合及篩選敲除菌株使用接合的方法將大腸桿菌WM3064中的重組pRE112-ΔflrB載體傳遞到維氏氣單胞菌中，通過抗性平板篩選并進(jìn)行PCR驗(yàn)證成功接合菌落。從圖2-A可知，泳道1、2、4、5條帶大小為2 000 bp，與預(yù)期大小一致，表明pRE112-ΔflrB載體成功導(dǎo)入野生型維氏氣單胞菌中。為篩選發(fā)生同源雙交換的基因敲除菌株，將成功接合的菌落接種培養(yǎng)并涂布于8%蔗糖平板上篩選，使用PCR驗(yàn)證敲除菌株。從圖2-B可知，泳道3為陰性對(duì)照，條帶大小為2 100 bp，泳道1、2 的PCR條帶大小為1 500 bp，減少的片段大小為預(yù)期敲除的部分，挑選到2個(gè)成功敲除菌株，為驗(yàn)證敲除的準(zhǔn)確性，使用 F0/R0引物擴(kuò)增并送生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，這2個(gè)菌株為成功敲除菌株。

2.3 檢測(cè)flrB基因敲除菌株的生長(zhǎng)情況通過測(cè)定在LB培養(yǎng)基中野生型和flrB基因敲除菌株的生長(zhǎng)曲線來研究flrB基因是否會(huì)影響維氏氣單胞菌C4的生長(zhǎng)。由圖3可知，野生型菌株和敲除flrB菌株生長(zhǎng)速率一致，說明敲除flrB后對(duì)維氏氣單胞菌的生 長(zhǎng)無影響。

圖3 野生型維氏氣單胞菌和flrB敲除株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig. 3 Determination of the growth curve of wild-type Aeromonas veronii and flrB knockout strain

2.4 檢測(cè)flrB基因敲除菌株的生物膜形成定量接種野生型維氏氣單胞菌和flrB敲除菌株并在30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h，吸出菌液使用PBS緩沖液清洗干凈，加入結(jié)晶紫染色，洗去多余的染料，用33%乙酸進(jìn)行溶解脫色后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD595的吸光度值。結(jié)晶紫染料可以特異性地染色生物膜，由圖4-A可知，敲除flrB后附著在孔壁上的生物膜變少，染色后顏色較淺，而野生型菌株生物膜形成較多，染色較深；使用冰乙酸溶解結(jié)晶紫進(jìn)行定量分析，由圖4-B可知，敲除flrB后生物膜形成顯著降低。說明敲除flrB后生物膜的形成顯著降低，在維氏氣單胞菌C4中flrB基因能促進(jìn)生物膜的形成。

圖4 野生型維氏氣單胞菌和flrB敲除菌株生物膜形成測(cè)定A. 96孔板生物膜形成染色結(jié)果；B. 使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定生物膜形成定量結(jié)果。Fig. 4 Determination of the biofilm formation of wild-type Aeromonas veroniis C4 and flrB knockout strainA. 96-well plate biofilm formation staining results;B. Quantitation of biofilm formation on microplate reader.

3 討 論

維氏氣單胞菌是一種廣泛存在的人魚共患致病菌，已對(duì)魚類養(yǎng)殖和人類健康造成了巨大的威脅[15]，但目前大多數(shù)相關(guān)研究?jī)H局限于病原菌的分離，未研究其致病機(jī)理，這不利于對(duì)病原菌的防治。研究維氏氣單胞菌的致病機(jī)制將有利于防治病原菌，減少維氏氣單胞菌在養(yǎng)殖業(yè)上造成的損失?；蚯贸翘骄可锉硇团c基因功能的重要方法，通過敲除候選基因觀察病原菌的致病性有利于研究發(fā)掘潛在致病機(jī)制。使用同源雙交換進(jìn)行基因敲除已在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中廣泛應(yīng)用，在納塔葡糖酸蠟桿菌、環(huán)己氨降解菌、金黃色葡萄球菌中都已通過同源雙交換成功進(jìn)行基因操作[16-18]。筆者在本研究中采用同源雙交換在維氏氣單胞菌中進(jìn)行分子操作，研究靶標(biāo)基因發(fā)揮的生物學(xué)功能，進(jìn)而解析維氏氣單胞菌的致病機(jī)理。

筆者以維氏氣單胞菌中鑒定出的FlrB/FlrC雙組分系統(tǒng)為靶標(biāo)，重點(diǎn)研究flrB基因發(fā)揮的功能。FlrB是雙組分系統(tǒng)FlrB/FlrC中的傳感器激酶，主要功能為感受信號(hào)并自磷酸化將磷酸基團(tuán)傳遞至同源反應(yīng)調(diào)節(jié)器上，從而啟動(dòng)下游一系列基因的表達(dá)，進(jìn)而影響生物學(xué)功能。FlrB/FlrC負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)菌鞭毛合成的3級(jí)基因的轉(zhuǎn)錄[19]。flrB的缺失會(huì)導(dǎo)致其同源效應(yīng)調(diào)節(jié)器不能磷酸化而失去激活下游基因表達(dá)的能力，進(jìn)而影響鞭毛的合成進(jìn)而影響鞭毛相關(guān)的致病表現(xiàn)，如運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞侵襲、生物膜形成。因此研究flrB基因在維氏氣單胞菌的功能對(duì)于解析維氏氣單胞菌的致病機(jī)制具有重要的意義。

本研究還鑒定了維氏氣單胞菌中flrB基因?qū)ιL(zhǎng)和生物膜形成的影響。研究結(jié)果表明，敲除flrB基因后并不影響維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)，flrB基因主要調(diào)控細(xì)菌鞭毛合成，主要影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)以及粘附，因此敲除flrB基因不影響生長(zhǎng)，該結(jié)果與空腸彎曲菌中鞭毛合成系統(tǒng)缺失但不影響生長(zhǎng)特性的研究結(jié)果一致[20]。敲除flrB基因后生物膜形成顯著降低，說明在維氏氣單胞菌中flrB具有促進(jìn)生物膜形成的功能，該結(jié)果與溶藻弧菌中flrB基因敲除表型的研究結(jié)果一致[13]。本研究可為解析維氏氣單胞菌的致病機(jī)制提供新的研究思路與作用靶標(biāo)。