金 玲，陳奕彬，李色東,5，劉 萍，李 健，呂建建

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266235；4.廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524022；5.湛江市海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心，廣東湛江 524039)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)原產(chǎn)于澳大利亞北部，俗稱澳洲淡水龍蝦，屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目擬螯蝦科，是世界上最名貴的淡水經(jīng)濟蝦種之一[1]。它具有個體大，食性雜，生長快，病害少，適應(yīng)能力強等養(yǎng)殖優(yōu)勢。因其可食用部分比率高、肉味鮮美、營養(yǎng)價值高而廣受歐美等國家歡迎[2,3]。我國內(nèi)地最早于1992年廣東珠海進行試養(yǎng)，隨后在福建、江蘇、浙江、江西、廣西等地進行了小規(guī)模試養(yǎng)，產(chǎn)業(yè)整體處于初級階段。目前，良種稀缺、親蝦品質(zhì)良莠不齊等因素嚴重制約了紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[4]。

遺傳多樣性是遺傳選育的基礎(chǔ)[5]。目前國內(nèi)關(guān)于經(jīng)濟甲殼類物種的不同地理群體遺傳多樣性分析已有不少的報道，如中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[6]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[7]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)等[8]。開展遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析對于了解紅螯螯蝦種質(zhì)資源現(xiàn)狀、育種潛力及制定育種方案具有重要意義[9]。

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSR)，因其多態(tài)性高、屬于共顯性遺傳、操作便捷等特點，目前已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析等研究[10-12]。Baker等[13]最早開發(fā)了紅螯螯蝦7個微衛(wèi)星位點。隨后，謝艷楠[14]開發(fā)了28個微衛(wèi)星位點，并對福建廈門、廣東廣州、上海崇明3個不同地理位置的紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。然而，自2011年以來，我國紅螯螯蝦群體遺傳多樣性是否發(fā)生改變或降低，亟需提供最新的遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)。

本研究利用微衛(wèi)星分子標記對我國廣東和臺灣兩個主要的紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行分析，旨在了解兩個群體的遺傳多樣性信息和遺傳結(jié)構(gòu)，同時為后續(xù)的紅螯螯蝦種質(zhì)資源評估及利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的紅螯螯蝦群體分別來自廣東和臺灣。每個群體30尾，雌雄比為1 ∶1。取背部適量的肌肉樣品共60份，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用TransGen Biotech的基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)其說明書提取紅螯螯蝦DNA，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，微量分光光度計測其濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選與條件優(yōu)化

本實驗所用引物序列均為之前已報道的SSR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。利用梯度PCR方法篩選SSR引物并確定其最適退火溫度，最終獲得10對符合實驗要求的引物(表1)。

1.2.3 PCR反應(yīng)及檢測

具體實施步驟如下：由3條引物進行PCR擴增，第1條是5′端帶有M13尾的正向引物(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)；第2條是SSR反向引物；第3條是帶有熒光標記的M13 通用引物(5′端用FAM、HEX、ROX熒光基團標記)。以上所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物準備就緒后利用篩選出的10個位點對60個紅螯螯蝦基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 3.2μL，M13正向引物(10 μmol/L) 0.4μL，反向引物(10 μmol/L) 1.6 μL，M13熒光引物(10 μmol/L) 1.6 μL，DNA模板小于1 μg，ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s；引物在各自退火溫度下復(fù)性30 s；72 ℃延伸1 min；34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。對PCR產(chǎn)物進行凝膠檢測并觀察其條帶，將符合條件的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用PopGene3.2[15]軟件來分析等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)(H)等；觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)以及Hardy-Weinberg平衡(P)檢驗等遺傳多樣性參數(shù)則利用Cervus 3.0.7軟件完成；用公式D=(Ho-He)/He計算遺傳偏離系數(shù)(D)[16]；用FSTAT[17]軟件計算近交系數(shù)(Fis)以及群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)。

2 結(jié)果

2.1 SSR標記在兩個群體中的分型

本研究對廣東和臺灣紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行微衛(wèi)星分型(圖1)。10個微衛(wèi)星位點在2個養(yǎng)殖群體中共檢測到83個等位基因，各個位點的Na介于3～17之間，其中位點HAo22數(shù)量最多(Na=17)，位點HAo04數(shù)量最少(Na=3)；Ne范圍為1.180～4.699，平均Ne為2.784(表2)。廣東和臺灣養(yǎng)殖群體在10個位點上的平均Na均為6；平均Ne分別為2.619和2.829(表3)。

表2 10個微衛(wèi)星位點上的遺傳多樣性參數(shù)

表3 2個紅螯螯蝦群體在10個微衛(wèi)星位點上的遺傳多樣性參數(shù)比較

2.2 兩個群體的遺傳多樣性分析

兩個紅螯螯蝦群體的平均Ho為0.464，平均He為0.557；PIC介于0.146～0.770之間，平均PIC為0.517，其中位點HAo22最高，位點HAo03最低(表2)。結(jié)果表明10個位點中6個位點顯示高度多態(tài)性(PIC>0.50)，2個位點顯示中度多態(tài)性(0.25

表4 2個紅螯螯蝦群體10個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性指數(shù)及近交系數(shù)

2.3 群體間的遺傳分化及近交系數(shù)評估

對紅螯螯蝦2個群體的遺傳分化指數(shù)Fst值進行分析，廣東群體和臺灣群體間的Fst為0.0969，屬于中等程度的分化(0.05

3 討論

遺傳多樣性分析結(jié)果表明，廣東群體平均PIC為0.465，呈中度多態(tài)性，而臺灣群體的平均PIC為0.517，呈高度多態(tài)性。整體而言，國內(nèi)兩個群體的遺傳多樣性水平較高。謝雁南等[14]利用微衛(wèi)星分子標記對廈門、廣州、崇明3個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示三個群體的平均PIC為0.451 ～ 0.480。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，表明經(jīng)過近十年的累代養(yǎng)殖，國內(nèi)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體仍保持在較高的遺傳多樣性水平。然而，相較Baker等[18]已報道的澳大利亞野生種群，國內(nèi)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平確有一定程度的下降，說明在今后的選育或保種過程中，仍需制定科學(xué)、合理的方案，以維持較高的群體多樣性水平。

Shannon指數(shù)H是判定遺傳多樣性水平的重要指標[19]，根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)，廣東群體和臺灣群體分別為1.069、1.192，進一步說明兩群體的遺傳多樣性較為豐富。Fst是反映群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。本研究中，紅螯螯蝦群體間的Fst值為0.0969，為中等程度遺傳分化(0.05

本研究通過微衛(wèi)星標記對廣東和臺灣紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行分析，得到其群體間的遺傳多樣性等信息。研究結(jié)果為紅螯螯蝦的遺傳多樣性評估、遺傳選育提供數(shù)據(jù)參考，有助于推動紅螯螯蝦種質(zhì)資源的合理保護與利用。