劉 彤，徐春生，祁鳳華，袁曉鳳，宋思佳

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

0 引言

腹瀉是犢牛常見的一種消化道疾病，常發(fā)生在犢牛三周齡左右，多發(fā)季節(jié)為初春、夏末和秋初，其危害犢牛的健康，治療不及時(shí)往往導(dǎo)致犢牛死亡率增加，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛的經(jīng)濟(jì)效益。生產(chǎn)中常用抗生素治療犢牛腹瀉，而抗生素易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)又會(huì)殺滅腸道有益菌群，引起腸道功能的紊亂。益生菌預(yù)防治療腹瀉是一種安全有效的選擇，益生菌可抑制部分腸道有害菌群，改善腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，達(dá)到治愈腹瀉的作用，且使用安全無殘留。

復(fù)合益生菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母菌按比例3∶3∶1組成。嗜酸乳桿菌可通過動(dòng)物胃腸道中微生物的競(jìng)爭(zhēng)排斥作用，幫助動(dòng)物建立有益的宿主胃腸道微生物區(qū)系，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、預(yù)防動(dòng)物疾病。殷金玲等[1]制成的免疫康可以從體液免疫、細(xì)胞免疫和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)方面改善小鼠的機(jī)體免疫力?？莶菅挎邨U菌可以促進(jìn)動(dòng)物采食、提高飼料利用率、改善動(dòng)物胃腸道平衡、增加動(dòng)物健康等。Lee等[2]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加小腸絨毛高度，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。布拉迪酵母菌可降低畜禽料重比、改善家禽生產(chǎn)性能、降低腹瀉的發(fā)生，可促進(jìn)畜禽腸道有益菌的增殖，產(chǎn)生乳酸從而降低腸道致病菌的含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)畜禽機(jī)體免疫因子的釋放和免疫器官的發(fā)育，進(jìn)一步增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力[3]。

腸膠質(zhì)細(xì)胞（EGCs）是腸神經(jīng)膠質(zhì)系統(tǒng)的重要組成部分，其分泌的亞硝基谷胱甘肽（GSNO）具有較好地促進(jìn)腸黏膜屏障的作用。有關(guān)犢牛小腸EGC 分泌GSNO 的研究未見有報(bào)道，本試驗(yàn)應(yīng)用益生菌作用于K99 感染犢牛，探究益生菌及K99 對(duì)犢牛小腸GSNO 分泌的影響，為益生菌在犢牛腹瀉中的應(yīng)用提供參考資料，亦為EGC 的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)在新疆軍墾曙瑞奶牛場(chǎng)完成，選擇健康，胎次、胎齡相近的荷斯坦公犢牛22頭，體重約為40kg。

1.1.2 試驗(yàn)試劑無水乙醇、95%乙醇、二甲苯（天津化工有限公司）；石蠟、中性樹膠（上海萬輝儀器有限公司）；牛GSNO 試劑盒（上海酶連生物科技有限公司）；4%的多聚甲醛（賽國科技有限公司）；伊紅、蘇木精（北京索萊寶科技有限公司）。大腸桿菌K99（含菌量為1×109CFU·g-1）和復(fù)合益生菌（由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和布拉迪酵母菌按3∶3∶1 比例組成，含菌量為1×109CFU·mL-1）來自石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院。

1.1.3 試驗(yàn)儀器滅菌高壓鍋（江明市東華器械有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；萊卡石蠟切片機(jī)（RM2235）；載玻片、蓋玻片（天津化工科技有限公司）；KD-T電腦生物組織攤烤片機(jī)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

犢牛自出生后飼喂足量的初乳及鮮乳。將選擇的22 頭犢牛隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組8 頭，常規(guī)飼喂，每日灌服10mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）；益生菌組6 頭，在試驗(yàn)開始第一天飼喂K99 10mL，之后每天飼喂復(fù)合益生菌；感染組8 頭，常規(guī)飼喂基礎(chǔ)上，每天灌服K99 10mL。試驗(yàn)期分別為7d、14d和21d，試驗(yàn)到期之時(shí)，于次日清晨晨飼前宰殺。

1.2.2 石蠟切片制作及病理觀察

犢牛頸動(dòng)脈放血宰殺后，剖開腹腔分別取小腸各段組織樣2cm，PBS 清洗管腔后將組織樣置于中性甲醛固定液中12h，脫水，透明，包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察攝片。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測(cè)定犢牛小腸內(nèi)GSNO的含量

1.2.3.1 樣品采集

分別從對(duì)照組、益生菌組、感染組隨機(jī)選取5頭牛，分離小腸，截取十二指腸、空腸和回腸段，沖洗掉腸道內(nèi)容物，于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.3.2 組織樣品處理

取小腸新鮮組織，用手工或勻漿器將其勻漿充分，4℃條件下3000r離心20min，仔細(xì)收集上清液用于分析。

1.2.3.3 ELISA方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50uL。

（2）加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。

（3）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100uL，空白孔除外。

（4）溫育：用封板膜封閉后置37℃溫育60min。

（5）配液：用蒸餾水將20 倍濃縮洗滌液稀釋20倍后備用。

（6）洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置30s棄去，重復(fù)5次，拍干。

（7）顯色：加入顯色劑，37℃避光顯色15min。

（8）終止：每孔加終止液50uL，終止反應(yīng)。

（9）測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm 下依序測(cè)量各孔吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15min 內(nèi)進(jìn)行。

（10）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換：測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）轉(zhuǎn)換成各孔的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用EXCEL 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并做多重比較，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 犢牛小腸病理切片觀察

2.1.1 十二指腸

如圖1中A1～A3所示可知，對(duì)照組犢牛腸絨毛比較完整，無出血現(xiàn)象，有個(gè)別絨毛斷裂的情況出現(xiàn)；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，如圖中箭頭所示為絨毛斷裂情況較多，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列比較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)較為正常。

圖1 犢牛十二指腸病理切片圖Figure 1 Pathological sections of duodenum of calves

2.1.2 空腸

如圖2中B1～B3所示，對(duì)照組犢牛腸絨毛比較完整，有個(gè)別絨毛斷裂的情況出現(xiàn)；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，箭頭所示為斷裂絨毛，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)較為正常。

圖2 犢?？漳c病理切片圖Figure 2 Pathological sections of jejunum of calves

2.1.3 回腸

如圖3 中C1~C3 所示可知，對(duì)照組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)比較完整；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，圖中箭頭標(biāo)示為絨毛斷裂情況，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，斷裂較少，排列較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)正常。

圖3 犢?；啬c病理切片圖Figure 3 Pathological sections of ileum of calves

2.2 犢牛小腸內(nèi)GSNO的含量變化

由表1 所列可知，三組犢牛小腸中GSNO 的含量各有差異，其中十二指腸中GSNO 含量三組處理間無顯著差異；空腸中益生菌組GSNO 含量雖高于對(duì)照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對(duì)照組和益生菌組均顯著高于感染組（P＜0.05）；回腸中益生菌組GSNO 含量高于對(duì)照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對(duì)照組和益生菌組均極顯著高于感染組（P＜0.01）。

表1 犢牛小腸GSNO含量變化（單位：mmol·L-1）Table 1 Changes of GSNO content in small intestine of calves（unit:mmol· L-1）

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌及大腸桿菌K99 對(duì)犢牛小腸形態(tài)的影響

大腸桿菌是造成犢牛腹瀉的主要原因之一，已有研究證實(shí)犢牛從7 日齡起灌服大腸桿菌K99，其腹瀉率從30%上升到70%，犢牛的腹瀉率顯著提高[4]。張雪[5]研究得出飼糧添加枯草芽孢桿菌可以提高肉雞后期（22—42日齡）生長(zhǎng)性能，且全期（1—42 日齡）效果不低于抗生素桿菌肽鋅。盧奇成等[6]的試驗(yàn)中，在犢牛早期（1—21d）飼糧中補(bǔ)充不同劑量的布拉氏酵母可以降低犢牛的腹瀉率，提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫力，減少犢牛的腹瀉。羅波文等[7]研究得出一定濃度的嗜酸乳桿菌可以提高細(xì)胞的抗氧化能力。邵青玲等[8]研究認(rèn)為腸絨毛高度是檢驗(yàn)小腸吸收能力的一個(gè)重要指標(biāo)。

從本試驗(yàn)HE 染色結(jié)果可以看出，對(duì)照組犢牛十二指腸、空腸及回腸腸絨毛完整，無出血現(xiàn)象；感染組腸絨毛有明顯的出血現(xiàn)象，絨毛斷裂、脫落，說明大腸桿菌K99在一定程度上會(huì)對(duì)犢牛腸道造成損傷，引起犢牛腹瀉；而益生菌組腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，無絨毛斷裂、脫落現(xiàn)象，表明益生菌一定程度上促進(jìn)腸道發(fā)育，對(duì)腸道有一定的保護(hù)作用。在十二指腸、空腸和回腸中，益生菌組的腸絨毛長(zhǎng)度高于對(duì)照組和感染組，感染組的腸絨毛長(zhǎng)度低于對(duì)照組，本試驗(yàn)中感染大腸桿菌K99可導(dǎo)致腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起犢牛腹瀉。而益生菌組腸絨毛較完整，結(jié)構(gòu)正常，說明復(fù)合益生菌對(duì)腸道有一定的保護(hù)作用。

3.2 復(fù)合益生菌及大腸桿菌K99 對(duì)犢牛小腸內(nèi)GSNO的影響

GSNO 是 EGCs 中的重要組成成分，而 EGCs 是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，EGCs 的缺失，反映了腸上皮組織屏障的損害，不利于腸道的發(fā)育[9]。呂健[10]研究指出源自EGCs 的S-GSNO 是一種新的腸屏障功能誘導(dǎo)物。S-GSNO 對(duì)上皮屏障功能的調(diào)節(jié)，可能是通過對(duì)連接體周圍F 肌動(dòng)蛋白的巰基亞硝基化和改變其表達(dá)來完成。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，益生菌組小腸中GSNO含量升高，而感染組小腸中GSNO 含量顯著降低，一定程度上反映復(fù)合益生菌具有促進(jìn)犢牛腸道發(fā)育的作用。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)中，犢牛感染大腸桿菌K99 導(dǎo)致腹瀉發(fā)生，而復(fù)合益生菌組小腸絨毛較完整，結(jié)構(gòu)正常，說明復(fù)合益生菌對(duì)腸道有一定的保護(hù)作用。并且感染組的GSNO 含量顯著下降，而益生菌組中含量增加，說明GSNO 可在一定程度上保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整，抑制大腸桿菌K99的致病作用。

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