康 亮，麥 慧，丁 玲，郭宏偉，朱 丹

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530021）

重樓(Paridis Rhizoma)是百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖[1]，主要分布于我國(guó)云南、四川、貴州、廣西等地[2]。其性苦，微寒，有小毒，主要功效為清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚，可用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲(chóng)咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]、抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、改善血流變[5]等作用。重樓的化學(xué)成分主要包括甾體皂苷類(lèi)、蛻皮激素類(lèi)、甾醇類(lèi)、黃酮類(lèi)等[6]，其中甾體皂苷是其主要活性成分。隨著我國(guó)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，重樓的市場(chǎng)需求激增，但重樓野生藥用資源有限，人工繁殖困難。因此，尋找重樓生物活性代替物成為了研究熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生真菌是指其生活史的部分或全部階段生存在健康植株內(nèi)而不引起植物明顯感染癥狀的一類(lèi)真菌，在分類(lèi)學(xué)和生態(tài)學(xué)上，這是一類(lèi)具有異質(zhì)性的生物類(lèi)群，主要隸屬于子囊菌亞門(mén)和半知菌亞門(mén)[7]。內(nèi)生真菌能在宿主植物中表現(xiàn)出多維度的相互作用，如誘發(fā)對(duì)病原體的防御反應(yīng)[8]、誘導(dǎo)寄生體內(nèi)次生代謝物積累、促進(jìn)宿主萌發(fā)與芽生長(zhǎng)[9]等，并能夠產(chǎn)生相關(guān)代謝物及其衍生物[10]。目前，研究者已從重樓分離出了多種內(nèi)生真菌，其代謝產(chǎn)物應(yīng)用廣泛，如抗菌、抗腫瘤等作用。隨著市場(chǎng)對(duì)重樓需求的日益增長(zhǎng)，重樓的野生資源受到嚴(yán)重威脅，而內(nèi)生真菌不僅可以促進(jìn)寄主產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的積累，其自身也可以產(chǎn)生各種類(lèi)型的化學(xué)成分，對(duì)資源保護(hù)而言具有重要意義。目前，關(guān)于重樓的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用等方面，而對(duì)重樓內(nèi)生真菌及其應(yīng)用研究尚屬起步階段。本文綜述了重樓內(nèi)生真菌多樣性、代謝產(chǎn)物及其生物活性、生物轉(zhuǎn)化方面的研究成果，以期為重樓內(nèi)生真菌的后續(xù)研究利用提供依據(jù)。

1 重樓內(nèi)生真菌的多樣性

由于重樓生長(zhǎng)環(huán)境的異質(zhì)性，形成了其內(nèi)生真菌的多樣性?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的重樓內(nèi)生真菌種屬信息見(jiàn)表1。周濃等[11]研究發(fā)現(xiàn)，云南重樓土壤菌群結(jié)構(gòu)顯示產(chǎn)地差異性，且道地產(chǎn)區(qū)的土壤微生物往往更加豐富；而一些特有內(nèi)生菌，則與藥材道地性息息相關(guān)。因此，挖掘重樓道地產(chǎn)區(qū)內(nèi)生真菌多樣性，是揭示其參與重樓有效成分形成的研究基礎(chǔ)。

表1 重樓內(nèi)生真菌分類(lèi)信息

2 重樓內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究

2.1 甾體皂苷類(lèi)

重樓內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中甾體皂苷主要分為薯蕷皂苷元糖苷與偏諾苷元糖苷。歐亞娟等[12]從七葉一枝花根莖中篩選出9株4屬高產(chǎn)薯蕷皂甙元活性的內(nèi)生真菌，發(fā)酵液薯蕷皂苷元濃度達(dá)27.82～51.23 μg/L。李艷冰等[18]通過(guò)與云南重樓組培苗進(jìn)行共生培養(yǎng)的方法，得到2 株產(chǎn)生重樓皂苷Ⅶ的菌株，分別是人參生柱隔孢（Cylindrocarponsp.）和木霉菌（Trichoderma viride）。汪玉梅等[15]發(fā)現(xiàn)云南重樓根莖中內(nèi)生真菌RP-S-4（Bacillussp.）可產(chǎn)生偏諾皂苷元，葉中的內(nèi)生真菌RP-L-4（Variovoraxsp.）可產(chǎn)生27-ol-pennogenin。

2.2 甾醇類(lèi)

陳金印[13]在七葉一枝花內(nèi)生真菌（Aspergillusfumigatus）的大米培養(yǎng)基發(fā)酵液中萃取出麥焦甾醇、過(guò)氧麥焦甾醇。Huang 等從云南重樓內(nèi)生真菌Fusariumsp.Ppf4 分離得到2 個(gè)甾醇，分別為5α,8αepidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol 和ergosta-8(9),22-dien-3β,5α,6β,7α-tetraol。

2.3 三萜類(lèi)

Zhao 等[19]從云南重樓內(nèi)生真菌Pichia guilliermondiiPpf9 中分離到1 個(gè)nordammarane triterpenoid。

2.4 其他代謝產(chǎn)物

重樓內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)十分豐富，除上述產(chǎn)物外，還存在苯丙素類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等。夏從芳[17]從云南重樓內(nèi)生真菌雜色曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中得到20 個(gè)丁內(nèi)酯類(lèi)化合物。李雪霜等[20]在七葉一枝花內(nèi)生真菌（Penicilliumsp.）中得到五個(gè)攜帶奇特雙環(huán)[4.4.1]環(huán)系甾體類(lèi)化合物。Zhang 等[21]采用水蒸汽蒸餾法從云南重樓內(nèi)生真菌Fusarium tricinctum中提取揮發(fā)油。Zhao 等[22]從云南重樓內(nèi)生真菌Pichia guilliermondiiPpf9 粗提物中分離出煙曲霉酸。Cheng 等[23]從云南重樓根莖內(nèi)生菌PCE45中分離得到一種抗菌肽。

野生重樓資源日益枯竭的條件下，利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)其相似化合物，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。甾體皂苷是人類(lèi)在重樓體內(nèi)獲取的主要活性物質(zhì)，占總化合物的86%[24]，已有大量研究表明，重樓內(nèi)生真菌在甾體皂苷的合成上具有重要作用。

3 重樓內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的活性研究

3.1 抗菌活性

抗生素的大量使用致使病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)，抗菌藥的研發(fā)迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)，重樓內(nèi)生真菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)中具有抑菌功能。Zhang等[21]從云南重樓內(nèi)生真菌Fusarium tricinctum中提取揮發(fā)油，其對(duì)試驗(yàn)菌的平均抑菌濃度（IC50）為17.8～31.6 μg/mL，對(duì)M.oryzae的抑菌濃度為204.3 μg/mL。Hu 等[25]試驗(yàn)表明，由云南重樓內(nèi)生真菌產(chǎn)生的二苯醚化合物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為（10.8±2.0）mm。Zhao 等[26]從云南重樓內(nèi)生真菌Gliomastix murorumPpf8 中得到2 種抗菌代謝產(chǎn)物，此兩種化合物的最低抑菌濃度（MIC）值為100～200 μg/mL。

隨著人類(lèi)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用得到了我國(guó)各級(jí)政府、科研機(jī)構(gòu)的高度重視與支持。其中，微生物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)是當(dāng)前較為流行的新型農(nóng)藥創(chuàng)制手段。例如來(lái)源于枯草芽孢桿菌的生物農(nóng)藥“紋曲寧”可用于防治水稻紋枯病[27]。盡管來(lái)源于重樓的內(nèi)生真菌具有較好的抑菌能力，但距離開(kāi)發(fā)利用仍有較長(zhǎng)的路程。

3.2 抗腫瘤活性

惡性腫瘤是危害人們生命的疾病之一，現(xiàn)多數(shù)天然化合物應(yīng)用到臨床抗腫瘤藥物中，并受到人們的青睞。通過(guò)植物內(nèi)生菌生產(chǎn)天然化合物是獲得新藥的重要途徑。夏從芳[17]研究發(fā)現(xiàn)云南重樓內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物Versicolactane D 具有很好的抗A549 和MCF7 細(xì)胞毒性，IC50值分別為3.2 μg/mL、2.5 μg/mL。劉艷輝等[28]從七葉一枝花中分離出內(nèi)生真菌Penicilliumsp，大米培養(yǎng)基發(fā)酵后得到3 種化合物對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性，分別為1,3,14-三甲氧基-6-甲基-9,10-蒽醌，bostrycin 和isorhodoptilometrin。

3.3 抗病毒活性

重樓內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物在抗病毒活性試驗(yàn)中具有較好的活性。夏從芳[17]從云南重樓內(nèi)生真菌雜色曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到了20 個(gè)丁內(nèi)酯類(lèi)化合物，其中terrephenol A，trrephenol B，asperphenol B，versicolactane D 和butylrolactone Ⅳ這5 個(gè)化合物具有較好的抗煙草花葉病毒活性。

3.4 其他作用

部分內(nèi)生真菌具有促進(jìn)重樓種子萌發(fā)的作用，程坤等[29]發(fā)現(xiàn)從云南重樓根莖中分離到的曲霉屬、頭孢霉屬、鐮孢屬、毛霉屬、青霉菌、木霉屬，均能促進(jìn)云南重樓種子的胚發(fā)育。秦穎[30]發(fā)現(xiàn)從云南重樓根莖上分離的雜色曲霉，用于發(fā)酵煙絲后，具有使煙絲中制香成分增加的作用。另外，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物重樓皂苷在中醫(yī)臨床上具有消炎、止血、抗氧化作用等作用。

4 生物轉(zhuǎn)化

4.1 萬(wàn)古霉素

宣群等[31]發(fā)現(xiàn)重樓內(nèi)生真菌產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum和Fusarium nematophilum可轉(zhuǎn)化萬(wàn)古霉素鹽酸鹽并產(chǎn)生新產(chǎn)物。

4.2 孕酮

孕酮生物轉(zhuǎn)化方式是在孕酮分子上引入羥基。李忠孝等[32]利用從云南重樓內(nèi)生菌株稻惡苗霉Fusarium moniliformeSheld.對(duì)孕酮進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究，共分離得2個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定后表明菌株YNCA1219對(duì)孕酮的轉(zhuǎn)化比較完全，且具有專一性。

4.3 重樓皂苷

He 等[33]利用云南重樓內(nèi)生菌進(jìn)行了重樓皂苷Ⅶ（PPL7）的生物轉(zhuǎn)化，得到能夠抑制乳腺癌化療耐藥活性的化合物ZH-2（pennogenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-Dglucopyranoside），與化療敏感的乳腺癌細(xì)胞相比，ZH-2對(duì)化療耐藥細(xì)胞的殺傷比PPL7更具選擇性。

5 小結(jié)與展望

盡管在重樓內(nèi)生真菌的分離篩選、代謝產(chǎn)物的分離、鑒定和開(kāi)發(fā)上已有了一定進(jìn)展，但依然存在若干問(wèn)題亟待解決。重樓內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，仍需要研究人員進(jìn)一步探索研究；此外，重樓內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)利用仍停留在研究階段，用于商業(yè)生產(chǎn)尚需解決內(nèi)生真菌培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率低、成本高、發(fā)酵過(guò)程難控制等問(wèn)題。重樓野生資源有限，與日益增加的市場(chǎng)需求形成強(qiáng)烈矛盾，解決該矛盾的關(guān)鍵在于尋找重樓主要代謝產(chǎn)物的代替物。而重樓內(nèi)生真菌是一個(gè)有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的微生物資源庫(kù)，通過(guò)篩選相應(yīng)的內(nèi)生菌，優(yōu)化發(fā)酵條件，建立穩(wěn)定可控的反應(yīng)體系來(lái)生產(chǎn)重樓活性物質(zhì)，有望緩解市場(chǎng)需求與資源短缺的矛盾。