許 珩，洪富美，*，趙 莉

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221004;2 徐州立新佳正醫(yī)藥科技有限公司，徐州 221100

非洛地平（felodipine）是一種對(duì)血管具有高選擇性的二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，主要抑制小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流，選擇性擴(kuò)張小動(dòng)脈，又因其對(duì)靜脈平滑肌和腎上腺素血管張力調(diào)節(jié)無影響，故不引起體位性低血壓；適用于各型高血壓、缺血性心臟病及心力衰竭的治療[1，2]。臨床應(yīng)用廣泛；但非洛地平會(huì)引起嚴(yán)重性低血壓和心動(dòng)過緩，故對(duì)老年患者采取治療藥物監(jiān)測(cè)，尤為重要。

由于非洛地平給藥劑量小，血藥濃度低且遇光不穩(wěn)定，常規(guī)測(cè)定方法難以滿足人體藥動(dòng)學(xué)研究的需要。在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，大多采用液液萃取法或固相萃取法。余鵬[2]等采用乙醚-正己烷（1∶1，v∶v）對(duì)血漿樣本進(jìn)行萃取，毒性較大，血漿使用量多，步驟繁瑣，成本高昂；吳正宇[3]等使用固相萃取板對(duì)血漿樣本進(jìn)行萃取，但檢測(cè)缺點(diǎn)并未改觀。

本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中非洛地平濃度，生物樣本前處理簡單快捷、回收率較好、無明顯基質(zhì)效應(yīng)、分析時(shí)間較短僅為3.5 min，有利于制備大量樣本并進(jìn)行高通量分析，從而縮短研究時(shí)間，節(jié)約成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，適用于非洛地平的臨床血藥濃度檢測(cè)及生物等效性實(shí)驗(yàn)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

ExionLCTM 高效液相色譜，TRIPLE QUADTM6500+三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（均美國AB SCIEX公司）；MSA6.6S-0CE-DM 百萬分之一天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 藥品與試劑

非洛地平對(duì)照品（純度：99.6%，批號(hào)：100717-201403，中國食品藥品檢定研究院，校正因子：0.99600）；非洛地平-d3內(nèi)標(biāo)[純度：96%（化學(xué)純）、99.9%（同位素純度）、99.83%（歸一化強(qiáng)度），校正因子：96%×99.9%×99.83%=0.95741），批號(hào)：4-RFS-1-1,加拿大Toronto Research Chemicals]；乙腈、醋酸銨均為HPLC 純度（美國J.T.Baker）；甲酸為ACS純度；水為超純水。

2 方 法

由于非洛地平在光照下不穩(wěn)定，易降解，所以本實(shí)驗(yàn)過程中注意避光。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，每個(gè)分析批制備兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Waters Xbridge-C18（2.1mm×50 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A 為水/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（100/0.2/0.1，v/v/v），流動(dòng)相B 為乙腈/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（100/0.2/0.1，v/v/v），梯度洗脫，程序見表1；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：20 μL。分析時(shí)間為3.5 min。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），以質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行正離子檢測(cè)，檢測(cè)離子分別為m/z 384.2→352.0（非洛地平），m/z 387.2→351.9（非洛地平-d3）。質(zhì)譜檢測(cè)器的主要參數(shù)：氣簾氣（CUR）207 kPa、碰撞氣（CAD）55 kPa，電離子噴霧氣壓（IS）5500 V，溫度400 ℃，離子源氣體1103 kPa，離子源氣體1655 kPa，非洛地平和非洛地平-d3的離子去簇電壓（DP）均為35 V，入口電壓（EP）均為12 V，碰撞活化電壓（CE）均為19 V，碰撞室出口電壓（CXP）均為11 V。

數(shù)據(jù)的采集和處理均使用Analyst 1.6.3 軟件。

2.2 溶液的配制

精密稱取非洛地平對(duì)照品及非洛地平-d3內(nèi)標(biāo)適量，用乙腈/水（50/50，v/v）分別配制成濃度為100 ng·μL-1的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱備用。用乙腈/水（50/50，v/v）稀釋儲(chǔ)備液配制成不同濃度的非洛地平工作溶液以及0.08 ng·μL-1內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

精密吸取血漿樣品200 μL 于96 深孔板中，添加0.08 ng·μL-1內(nèi)標(biāo)溶液10 μL 至每一樣本，空白及殘留樣本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）?；靹蚝蠹尤胍译?00μL，20℃下以4000r·min-1離心10min，轉(zhuǎn)移700 μL 上清液至另一96 深孔板中，于純凈氮?dú)饬飨拢?0°C 蒸發(fā)干燥，固體物中加入250 μL 乙腈/水/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（55/45/0.2/0.1，v/v/v/v）復(fù)溶，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本及質(zhì)控樣本的配制

在1.5 mL EP 管中，分別加入570 μL 空白血漿與30 μL 相應(yīng)濃度非洛地平的標(biāo)準(zhǔn)曲線用工作溶液或質(zhì)控用工作溶液，渦旋混勻即可得到0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1、3.2、4 ng·mL-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本及0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-1濃度的質(zhì)控樣本。

另配制空白樣本、殘留樣本及零濃度樣本各600 μL。按“2.3”項(xiàng)預(yù)處理，殘留樣本為未添加分析物與內(nèi)標(biāo)的空白樣本，按樣本步驟制備后，接續(xù)于每一個(gè)分析批的校正標(biāo)樣ULOQ 后分析，以評(píng)估殘留效應(yīng)。

3 方法學(xué)驗(yàn)證及結(jié)果

3.1 選擇性測(cè)試

選取6 個(gè)不同來源的空白血漿樣本以及3 個(gè)不同來源的空白溶血血漿樣本，并分別按“2.4”項(xiàng)下配制標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，以評(píng)價(jià)空白血漿對(duì)分析物及內(nèi)標(biāo)的干擾；另制備定量上限樣本（ULOQ）于空白樣本（無內(nèi)標(biāo)），以評(píng)價(jià)分析物對(duì)內(nèi)標(biāo)的干擾。同時(shí)，利用該分析批的零濃度樣本，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)對(duì)分析物的干擾評(píng)估。按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”檢測(cè)條件進(jìn)樣分析，并記錄色譜圖。在符合非洛地平保留時(shí)間處的干擾峰響應(yīng)均低于該分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量下限樣本（LLOQ）的非洛地平響應(yīng)的20.0%；在符合內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處的干擾峰響應(yīng)均低于該分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量下限樣本的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5.0%，見圖1。

圖1 典型血漿樣品色譜圖

非洛地平和非洛地平-d3的保留時(shí)間（RT）分別在1.415 min 左右和1.417 min 左右，峰形良好，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾本品及其內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

3.2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

按“2.4” 方法配制0.06、2、3 ng·mL-1（QL、QM、QH）3 個(gè)濃度的對(duì)照品血漿樣品，QL 為3 倍的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量下限（LLOQ）濃度，QM 為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量上限（ULOQ）的50%，QH 為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量上限（ULOQ）的75%。每個(gè)濃度平行3 個(gè)樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，即為制備后樣本。取空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下從“空白及殘留樣本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）”開始操作，即為非制備后樣本，非制備后樣本共三個(gè)濃度，每個(gè)濃度制備3 個(gè)平行樣本。選擇6 種不同來源的空白人血漿，操作同非制備后樣本，即為基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試樣本，每個(gè)濃度制備6個(gè)平行樣本（每個(gè)來源1 個(gè)）。配制低、中、高3 種濃度的分析物復(fù)溶液（分析物濃度分別為0.0336、1.12、1.68 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)為2.24 ng·mL-1，溶液中分析物與內(nèi)標(biāo)濃度按QL、OM、QH 上機(jī)濃度進(jìn)行回算），用以復(fù)溶非制備后樣本、基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試樣本、不含生物基質(zhì)的樣本(以純水為基質(zhì))。不含生物基質(zhì)的樣本操作同基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試樣本，每個(gè)濃度1 個(gè)樣本，每個(gè)樣本分析6 次。復(fù)溶后三者的上機(jī)濃度與QL、QM、QH 相同。計(jì)算提取回收率（制備后樣本的平均響應(yīng)值/非制備后樣本的平均響應(yīng)值）與內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子（分析物基質(zhì)因子=含基質(zhì)的分析物樣本響應(yīng)/不含基質(zhì)的分析物樣本響應(yīng)平均值，內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子=含基質(zhì)的內(nèi)標(biāo)樣本響應(yīng)/不含基質(zhì)的內(nèi)標(biāo)樣本響應(yīng)平均值，內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子=分析物基質(zhì)因子/內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子），計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)定結(jié)果

對(duì)此表明，分析物和內(nèi)標(biāo)的提取回收率達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)，非洛地平無明顯空白血漿基質(zhì)效應(yīng)，不影響分析物的定量分析。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限（LLOQ）

按“2.4”項(xiàng)方法配制8 個(gè)濃度級(jí)別的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)方法處理并進(jìn)行分析，記錄非洛地平與非洛地平-d3的色譜峰面積。共制備分析批10 個(gè)，每個(gè)分析批含2 條標(biāo)準(zhǔn)曲線，一共20 條標(biāo)準(zhǔn)曲線。以分析物（非洛地平）與內(nèi)標(biāo)（非洛地平-d3）的色譜峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，血漿中分析物的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，加權(quán)為1/X2，得到非洛地平的線性回歸方程：Y=0.267X-8.01×10-5（r=0.998 9），結(jié)果表明非洛地平在0.02～4 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好，最低定量限為0.019 62 ng·mL-1（準(zhǔn)確度在80%～120%，精密度RSD＜20%）。

3.4 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)方法配制0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-15 種不同濃度的質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度至少進(jìn)行6 個(gè)樣品分析，共測(cè)定3 個(gè)分析批，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，非洛地平的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見表2。結(jié)果表明，5 種不同濃度的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度偏差均小于15%，符合生物樣本測(cè)試的要求。

3.5 穩(wěn)定性考察

按“2.4”項(xiàng)方法配制0.06、3 ng·mL-12 種濃度含藥血漿樣品，每一濃度平行3 個(gè)樣本。樣本在室溫放置52 h 后處理，測(cè)定濃度，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為11.2%、4.5%；處理樣本后于自動(dòng)進(jìn)樣器（15℃）中放置59 h，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為9.7%、3.1%；處理樣本后于4 ℃冰箱中放置50 h，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為9.5%、4.6%。于-20 ℃下凍融樣本5 次后，無輔助解凍，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為6.5%、5.9%，水浴解凍，測(cè)定值與0 h的平均偏差分別為3.3%、5.6%；于-80 ℃下凍融樣本5 次后，無輔助解凍，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為4.7%、3.3%，水浴解凍，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為-1.2%、1.1%。在-20℃冰箱儲(chǔ)存樣本32 d后，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為-0.1%、1.0%；在-80 ℃冰箱儲(chǔ)存樣本32 d 后，測(cè)定值與0 h 的平均偏差分別為0.4%、-3.2%。結(jié)果表明，非洛地平在各考察條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

3.6 殘留效應(yīng)

在每個(gè)分析批最高濃度的校正標(biāo)樣（ULOQ）后面進(jìn)樣空白樣本作為殘留測(cè)試樣本。殘留測(cè)試樣本在分析物保留時(shí)間處的干擾峰的響應(yīng)均低于該標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量下限樣本中非洛地平響應(yīng)的20.0%，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處的干擾峰的響應(yīng)均低于定量下限樣本中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5.0%。結(jié)果表明，該方法殘留可忽略不計(jì)，不影響定量分析。

3.7 方法應(yīng)用

本試驗(yàn)經(jīng)過常州市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。12 位受試者隨機(jī)分為兩組，均在空腹?fàn)顟B(tài)下單次口服5 mg非洛地平緩釋片受試制劑和參比制劑。第一個(gè)周期，第一組給予受試制劑，第二組給予參比制劑。經(jīng)過7 天的清洗期后，進(jìn)行交叉互換。第二周期，第一組給予參比制劑，第二組給予受試制劑。測(cè)定其服藥前（0 h）及服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、12、24、36、48 h 的非洛地平血藥濃度，受試制劑與參比制劑的Cmax分別為（1.56±1.15）ng·mL-1、（1.39±1.09）ng·mL-1，藥-時(shí)曲線吸收、分布、消除形態(tài)基本完整，見圖2。

圖2 受試者口服受試、參比制劑血漿中非洛地平的藥-時(shí)曲線

4 討論

非洛地平具有光不穩(wěn)定性，在溶液和血漿樣本中經(jīng)室內(nèi)日光燈照射10 min 后降解率即超過15%[4]，應(yīng)選用避光的儲(chǔ)備容器，并在避光條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS 法，具有色譜分離與質(zhì)譜分離的雙重功能，依靠質(zhì)譜的分辨能力區(qū)分不同物質(zhì)的色譜峰，抗干擾能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)沉淀法進(jìn)行生物樣本前處理，操作簡單快捷且定量下限更低，為0.01962 ng·mL-1；但提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果、批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度與精密度尚存在不足。本實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用樣本量較少，結(jié)果存在個(gè)體差異，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量。非洛地平臨床應(yīng)用劑量小，血藥濃度極低，對(duì)分析方法的穩(wěn)定性要求較高，在優(yōu)化色譜過程中，選用Waters Xbridge-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）色譜柱，可以獲得較好的峰形及較佳的保留時(shí)間，空白基質(zhì)背景較低，可以較好地分離分析物和排除雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)考察了甲酸和醋酸銨對(duì)色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸的加入為非洛地平提供了對(duì)稱峰形，添加醋酸銨增強(qiáng)了對(duì)分析物的保留。本方法每個(gè)分析批制備兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線使定量更加準(zhǔn)確。采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，其與待測(cè)物分子性質(zhì)一致，可最大限度地消除分析方法的誤差，干擾小、定量結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、變異性小。在文獻(xiàn)[3，4]中，分析時(shí)間均大于5 min，本實(shí)驗(yàn)分析時(shí)間僅為3.5 min，縮短了樣本的分析周期，有利于大樣本待測(cè)物的分析，提高工作效率，節(jié)約成本，能滿足非洛地平緩釋片的人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性的研究。