張 圓，孫玉娣，石蓓佳，陸益紅*

1 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 生物技術(shù)藥品檢驗一室，南京 210019;2 中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210009

云芝胞內(nèi)糖肽是運用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，從雜色云芝菌（Polystictus versicolor（L）.Fr.）經(jīng)深層培養(yǎng)，由菌體提取獲得的糖肽類物質(zhì)[1]。

核堿（Nucleobase）是指一類含氮堿基，是在DNA 和RNA 中起配對作用的部分，包括嘌呤堿和嘧啶堿。核苷（Nucleoside）是核堿與核糖或脫氧核糖縮合而成，是核酸和核苷酸的主要組成成分，參與RNA和DNA 組成。核苷和核堿的組成對于評價真菌類藥材及其提取物具有重要的意義。核苷和核堿類成分是生物細(xì)胞的基本組成元素，參與DNA 代謝過程、維持生命活動，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等生理作用[2]。研究核苷和核堿組成對云芝胞內(nèi)糖肽質(zhì)量控制有著積極作用。本文采用HPLC-UV 法，對云芝胞內(nèi)糖肽中核苷和核堿組成和含量進(jìn)行了測定[3]。

1 儀器與藥品、試劑

儀器：島津LC20AD-UV 檢測器。

對照品：11 種核苷和核堿對照品，見表1。

表1 11 種核苷和核堿對照品信息表

樣品：云芝胞內(nèi)糖肽對照品（批號140692-200301，中國食品藥品檢定研究院）；云芝胞內(nèi)糖肽原料：A 公司（批號S-30200601），B 公司（批號20200101）；C 公司云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（批號190203，含量0.5 g）；云芝胞內(nèi)糖肽膠囊、云芝胞內(nèi)糖肽片樣品共計54 批（含量0.5 g 原料均來自B 公司，制劑處方中無輔料或輔料無干擾）。B 公司提供菌絲體水提醇沉產(chǎn)物（產(chǎn)物1）和培養(yǎng)液濾液醇沉產(chǎn)物（產(chǎn)物2）。A 公司提供的原料中僅含有菌絲體水提醇沉產(chǎn)物。

化學(xué)計量學(xué)軟件：ChemPattern 2020 版，科邁恩（北京）科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：月旭AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 為水，流動相B 為甲醇，按表2 進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序

系統(tǒng)適用性：在對照品溶液（1 μg·mL-1濃度）的色譜圖中，理論板數(shù)按腺嘌呤峰計算不低于2000，各核苷和核堿色譜峰之間的分離度應(yīng)＞1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取表1 中11 種核苷和核堿對照品適量，加水溶解并稀釋成每1ml 中各含1、2、5、10、20、50、100 μg 的系列混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取云芝胞內(nèi)糖肽膠囊內(nèi)容物、云芝胞內(nèi)糖肽片研細(xì)，精密稱取200 mg，置20 mL量瓶中，加水15 mL，超聲振蕩30 min，冷卻至室溫后用水稀釋至刻度，5000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.22 μm 濾膜過濾，即得。

2.3 含量測定

精密量取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算出各樣品中核苷和核堿的含量。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍 取11 種混合對照品溶液，用水稀釋，配制成含11 種核苷和核堿各1、2、5、10、20、50、100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，以峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得各組成分在1～100 μg·mL-1范圍的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r＞0.9940）。表明各組分線性關(guān)系良好。測定結(jié)果見表3；分離圖譜見圖1。

表3 11 種核苷和核堿的分析方法驗證結(jié)果（n=6）

圖1 混合對照品核苷和核堿的HPLC 色譜圖

2.4.2 進(jìn)樣精密度試驗 取同一濃度混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%，計算各峰峰面積的RSD%（n=6）。精密度考察結(jié)果顯示，各峰峰面積的RSD 均＜1.0%，精密度良好。結(jié)果見表3。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法，從“加水15 mL 起”同法處理，測定重復(fù)性。各峰峰面積的RSD 均＜3.0%。結(jié)果見表3。

2.4.4 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的樣品6 份，精密稱取200 mg 置20 mL 量瓶中，分別加入含各核苷和核堿100 μg·mL-1的對照品溶液1 mL，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法，從“加水15 mL 起”同法處理，測定其峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算加樣回收率%和RSD%。各成分回收率分別在81.4%～98.7%。結(jié)果見表3。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液和供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，各峰峰面積的RSD均＜0.5%，對照品溶液和供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 各樣品核苷和核堿總量見表4。

表4 核苷和核堿組成和含量結(jié)果（%，云芝胞內(nèi)糖肽含量）

2.6 檢品成分說明

2.6.1 在B 公司原料及54 批云芝胞內(nèi)糖肽膠囊/片中含有較多的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷及少量胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤等。B 公司原料（批號20200101）和C 公司云芝胞內(nèi)糖肽制劑（批號190203）的HPLC 圖分別見圖2 和圖3。

圖2 B 公司原料（批號20200101）核苷和核堿的HPLC 色譜圖

圖3 C 公司云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（批號190203）（原料由B 公司提供）核苷和核堿的HPLC 色譜圖

2.6.2 A 公司來源的原料和中檢院對照品含有較多的尿苷、鳥苷和腺苷，為優(yōu)勢代謝成分及少量胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤等，中檢院對照品核苷和核堿總量約為B 公司來源的原料的兩倍，種類和含量均有明顯區(qū)別，見圖4、圖5。

圖4 云芝胞內(nèi)糖肽對照品（中檢院，140692-200301）核苷和核堿的HPLC 色譜圖

圖5 A 公司原料（S-30200601）核苷和核堿的HPLC 色譜圖

2.6.3 菌絲體（產(chǎn)物1）中的核苷種類與B 公司原料一致（見圖6）。B 公司的培養(yǎng)液（產(chǎn)物2）中未檢出核苷，與細(xì)胞外無生命活動有關(guān)（見圖7）。

圖6 產(chǎn)物1 核苷和核堿的HPLC 色譜圖

圖7 產(chǎn)物2 核苷和核堿的HPLC 色譜圖

2.6.4 多元統(tǒng)計分析技術(shù)-主成分分析法區(qū)分不同生產(chǎn)工藝樣品 采用ChemPattern 2020 版軟件[4]的多元統(tǒng)計分析技術(shù)-主成分分析法，以9 批B 公司膠囊樣本中各核苷和核堿的含量建立共有模式，對樣本間的相關(guān)性和主成分貢獻(xiàn)率進(jìn)行分析。

各樣本多元統(tǒng)計分析獲得的主成分分析聚類得分圖和載荷圖（PCA 圖）見圖8。2D PCA 圖顯示：其他廠家共45 批膠囊/片樣本游離糖組成與自建的共有模式同群，產(chǎn)物1、中檢院對照品、A 公司原料、產(chǎn)物2 與自建的共有模式離群。

圖8 核苷和核堿組成測定主成分分析聚類得分圖和載荷圖（PCA 圖）

結(jié)合載荷圖可知，尿苷、腺苷為樣本識別的主要因素；其次為鳥苷、次黃嘌呤。產(chǎn)物2 因不含核苷成分而離群，中檢院對照品、A 公司原料因鳥苷、腺苷等含量高而離群，產(chǎn)物1 因次黃嘌呤、尿苷含量較高而離群。

綜合聚類得分圖和載荷圖的結(jié)果，不同原料來源的聚類區(qū)分，可在核苷和核堿的含量差異、比例差異上得到體現(xiàn)：如A 公司來源的對照品和原料含有較多的鳥苷和腺苷，產(chǎn)物1（菌絲體成分）含有較多的尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、鳥苷和腺苷。產(chǎn)物2（培養(yǎng)基成分）不含核苷成分，如將其與產(chǎn)物1 混合作為原料，可能導(dǎo)致藥效的下降。

3 討論

3.1 考察了不同色譜柱的耐用性，如月旭AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Luna-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters Xbridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），結(jié)果各色譜峰分離度均良好。

3.2 對提取溶劑、提取方式、超聲時間等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以水為溶劑，超聲提取30 min 時，核苷和核堿提取效率較高，且含量較為穩(wěn)定。

3.3 對新建立的核苷和核堿檢測方法進(jìn)行了方法學(xué)驗證，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.9940，11 種成分的線性均在1～100 μg·mL-1，儀器精密度良好（RSD＜2%）、樣品回收率在81.4%～98.7%，均能滿足云芝胞內(nèi)糖肽中測定核苷和核堿成分的要求。該方法前處理簡單，檢測方法靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確。