王翊豪，李世昌，劉春路，趙艷麗，鄭國(guó)偉，徐福榮

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500）

0 引言

滇重樓(Pairs polyphylla var.yunnanensis)隸屬百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)，是多年喜陰草本植物，主要分布于中國(guó)的云南、四川和貴州一帶，多生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌草叢背陰坡或陰濕山谷中[1]，其根莖具有清熱解毒、消腫散瘀、涼肝定驚等功效，被2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載[2]。由于滇重樓藥用價(jià)值高，是云南白藥、熱毒清、宮血寧膠囊等多種中成藥的主要原料，全國(guó)醫(yī)院、藥廠對(duì)滇重樓的需求量逐年增大[3]。而產(chǎn)區(qū)的重樓藥材多年以來主要依賴于野生采挖，長(zhǎng)期的掠奪式采挖導(dǎo)致野生滇重樓藥材幾近枯竭，現(xiàn)已被列為云南省30種稀缺瀕危天然藥物之一[4]。深入開展滇重樓的栽培適應(yīng)性研究，找到滇重樓的生長(zhǎng)發(fā)育和皂苷積累的最適環(huán)境因子是當(dāng)前滇重樓種植中亟需解決的重點(diǎn)問題。

近年來，已有相關(guān)研究對(duì)滇重樓的引種馴化和栽培進(jìn)行探索。冼康華等[5]利用不同濃度植物激素和變溫層積方式對(duì)重樓種子進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)激素和溫度處理對(duì)不同來源滇重樓種子萌發(fā)時(shí)間及萌發(fā)率的影響不同。Liao等[6]對(duì)重樓種子進(jìn)行RNA測(cè)序，并與種子成熟期收獲的莖、葉、根組織的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較以及層積過程轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)試驗(yàn)，得出95個(gè)代謝基因和62個(gè)信號(hào)基因與植物生長(zhǎng)激素有關(guān)、71個(gè)已知種子休眠/萌發(fā)相關(guān)基因的同源基因，證實(shí)了多種激素和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)滇重樓種子的影響。黃艷萍等[7]通過研究不同接種時(shí)期對(duì)叢枝菌根(AM)真菌侵染的滇重樓幼苗生長(zhǎng)發(fā)育，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌有利于其甾體皂苷成分含量的累積。王騫等[8]以采自云南、貴州、四川33個(gè)產(chǎn)地的滇重樓植株及其根莖為研究對(duì)象，測(cè)定植株的7項(xiàng)表型性狀的變異，并采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)皂苷含量的變化，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的滇重樓在表型和重樓皂苷含量方面差異很大。KANG等[9]采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)，初步鑒定了重樓根莖提取物中的98個(gè)化合物，且均為首次從天然植物中分離得到。Ling等[10]對(duì)休眠種子及其種皮的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了測(cè)序，找到了263個(gè)保守的miRNAs通過直接和間接調(diào)控方式參與滇重樓種子的細(xì)胞、代謝和遺傳信息處理，為后續(xù)破除滇重樓種子休眠研究提供理論基礎(chǔ)。滇重樓產(chǎn)區(qū)、品種復(fù)雜，關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)滇重樓的生理特性差異，以及滇重樓從一個(gè)產(chǎn)區(qū)引種到其他產(chǎn)區(qū)后的生理相響應(yīng)模式變化的研究卻較少。

利用光合作用積累的有機(jī)物可占植物總干物質(zhì)的90%～95%[11]。通過對(duì)植物光合特性研究，有助于優(yōu)化栽培管理，從而提高產(chǎn)量，帶來經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。作為重要的藥用植物，滇重樓光合能力的研究取得了一定的進(jìn)展。Qiang等[13]研究了2個(gè)滇重樓品種對(duì)二氧化碳濃度升高的反應(yīng)，得出在高CO2脅迫下云南西部品種比云南中部表現(xiàn)出更強(qiáng)的光合作用活性和更高的生物活性物質(zhì)含量，證明滇重樓對(duì)CO2濃度升高的反應(yīng)可能與其自然棲息地的影響有關(guān)。沈昱翔等[14]發(fā)現(xiàn)多種叢枝菌根真菌可以促進(jìn)滇重樓幼苗期葉片葉綠素合成，進(jìn)而提高幼苗光合作用能力；曹嘉芮等[15]發(fā)現(xiàn)不同光強(qiáng)藍(lán)光對(duì)滇重樓葉片光能轉(zhuǎn)換效率及反應(yīng)活性影響不顯著，滇重樓皂苷含量隨藍(lán)光光強(qiáng)的增加呈先增后降的趨勢(shì)；侯秀麗等[16]研究滇重樓凈光合速率及相關(guān)因子的日變化，分析得出光有效輻射和空氣溫度直接影響滇重樓凈光合速率的日變化；劉杰等[17]通過噴施不同種配方的葉面肥，提高了滇重樓最大光合速率；何忠俊等[18]通過施用不同形態(tài)氮，對(duì)盆栽滇重樓生長(zhǎng)及有效成分的積累進(jìn)行試驗(yàn)，提出了最適宜滇重樓種植的氮素形態(tài)。以往的試驗(yàn)均注重于脅迫對(duì)滇重樓生長(zhǎng)等條件的影響，而鮮有研究涉及不同自然條件環(huán)境對(duì)滇重樓光合作用的影響。

植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)和能量最終都來源于光合作用[19]。植物光合作用的強(qiáng)弱，與其有效成分含量和總生物量有密切關(guān)系[20]。以往對(duì)滇重樓的研究多集中在植物栽培、植物化學(xué)、藥理作用等方面，對(duì)比較不同產(chǎn)地和相同產(chǎn)地不同來源的滇重樓光合特性研究較少[21-23]。本試驗(yàn)對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地相同品種和相同產(chǎn)地不同品種的滇重樓光合特性展開研究，旨在探討不同產(chǎn)地種源滇重樓的生產(chǎn)潛能，為滇重樓優(yōu)良品種的選育提供依據(jù)，分析滇重樓光合作用適宜的生態(tài)條件，為制定滇重樓高產(chǎn)栽培技術(shù)以及引種馴化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及材料

試驗(yàn)種源為取自云南省麗江市玉龍縣、麗江市華坪縣、大理州永平縣、曲靖市馬龍區(qū)、曲靖市麒麟?yún)^(qū)、曲靖市師宗縣6個(gè)產(chǎn)地處于結(jié)實(shí)期的滇重樓（表1），經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)徐福榮研究員鑒定為百合科植物滇重樓。

表1 不同產(chǎn)地滇重樓地理位置及氣候概況

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 利用Li-6800便攜式光合作用系統(tǒng)(Li-COR，USA)于8月18日—9月2日連續(xù)晴朗天氣測(cè)定不同產(chǎn)地種源滇重樓的葉片氣體交換參數(shù)，確保試驗(yàn)前植物處于正常光合作用狀態(tài)。測(cè)定時(shí)不同產(chǎn)地的每個(gè)種源滇重樓隨機(jī)選擇標(biāo)記健壯植株3株，以每株植株上部、受光照條件良好健康成熟的展開葉作為測(cè)試葉，測(cè)定時(shí)用鉛筆輕畫一條線以保證葉室每次夾在同一位置，并要保持葉片自然生長(zhǎng)角度不變。還要保證葉室內(nèi)盡可能少的涵蓋葉脈部分，以減少試驗(yàn)選材不一致導(dǎo)致的誤差。同一產(chǎn)地不同品種的滇重樓除上述處理外，在保證環(huán)境條件一致的前提下，還要盡可能地選取相隔較遠(yuǎn)的位置進(jìn)行采樣試驗(yàn)，以免不同品種間產(chǎn)生雜交帶來的試驗(yàn)誤差。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法 測(cè)定于上午天氣晴朗日照充足時(shí)進(jìn)行，每處理重復(fù)3株，每葉讀取3個(gè)數(shù)據(jù)，最后計(jì)算均值。試驗(yàn)時(shí)間根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂驐l件一般選擇在8:00—11:30，盡量避免植物“午休”帶來的影響。由于外界環(huán)境因子多樣且不可控，測(cè)定時(shí)葉室大小為6 cm2，溫度與相對(duì)濕度為環(huán)境數(shù)值，CO2濃度約(400±10)μmol/mol，每個(gè)點(diǎn)穩(wěn)定1 min后讀數(shù)。測(cè)定參數(shù)包括葉片凈光合速率[Pn，μmol/(m2·s)]、蒸騰速率[Tr，mmolH2O/(m2·s)]、氣孔導(dǎo)度[Gs，μmol/(m2·s)]、胞間CO2濃度(Ci，μmol/mol)等，所有測(cè)定值均由儀器自動(dòng)記錄。并根據(jù)記錄數(shù)據(jù)由式(1)計(jì)算單葉瞬時(shí)水分利用效率(WUE)、胞間CO2濃度與環(huán)境CO2濃度比值(Ci/Ca)等值[24]。

光響應(yīng)曲線測(cè)定。采用開放式氣路，光合有效輻射(PAR)設(shè)置梯度為2000、1800、1500、1000、700、500、300、200、150、100、70、30、0 μmol/(m2·s)。測(cè)定前要進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定時(shí)葉室溫度與相對(duì)濕度均由儀器自動(dòng)控制。每片葉片待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后連續(xù)讀取13個(gè)數(shù)據(jù)。對(duì)PAR在0～200 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)，同時(shí)求Pn-PAR曲線初始斜率，即為表觀量子效率(AQY)，Pn最大時(shí)的光強(qiáng)為光飽和光強(qiáng)(LSP)[25]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理以及表格繪制，以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，并通過PRISM軟件繪制光響應(yīng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地滇重樓葉片的光響應(yīng)特征參數(shù)

由圖1可得出，玉龍、華坪、永平、馬龍、曲靖、師宗產(chǎn)地滇重樓光飽和點(diǎn)分別為658.66、553.45、902.66、578.66、525.33、304.00 μmol/(m2·s)。由外置光量子傳感器記錄得玉龍、華坪、永平、馬龍、曲靖、師宗產(chǎn)地遮光后的光強(qiáng)分別為1070.99、553.64、1384.32、608.96、504.99、465.53 μmol/(m2·s)。由此可以看出，除麗江市華坪縣與曲靖市麒麟?yún)^(qū)的產(chǎn)地遮光后的光照強(qiáng)度與植物最適光照強(qiáng)度近似外，麗江市玉龍縣與大理州永平縣的光照強(qiáng)度均遠(yuǎn)大于滇重樓植物光飽和點(diǎn)的光強(qiáng)。

圖1 滇西及滇東南不同產(chǎn)地滇重樓葉片光響應(yīng)曲線

另由圖1可以看出，采自滇西產(chǎn)地（玉龍、華坪、永平）滇重樓的光響應(yīng)曲線均高于滇東南產(chǎn)地（馬龍、曲靖、師宗）。滇東南產(chǎn)地的光合速率低于2 μmol/(m2·s)，不足滇西產(chǎn)地的光合速率的30%。但滇東南產(chǎn)地的滇重樓光合作用能力比較一致，而滇西產(chǎn)地下的滇重樓差異比較大，其中采自麗江市玉龍縣的滇重樓光合速率僅為麗江市華坪縣和大理州永平縣滇重樓的50%。故推測(cè)滇西產(chǎn)地所產(chǎn)滇重樓可能比滇東南產(chǎn)區(qū)滇重樓更容易積累地下生物量等有效成分，但在滇重樓種植過程中必須根據(jù)當(dāng)?shù)丨h(huán)境嚴(yán)格控制遮蔭條件，保證滇重樓在合適條件下生長(zhǎng)。

表2 為滇東南與滇西6個(gè)產(chǎn)地下滇重樓的光合參數(shù)。從中比較滇西與滇東南的光合特性可以得出，滇西3個(gè)產(chǎn)地（麗江、華坪、永平）的滇重樓凈光合速率均顯著大于滇東南3個(gè)產(chǎn)地（馬龍、曲靖、師宗），滇東南部分樣品的凈光合速率不足滇西的20%。采自麗江市華坪縣和大理州永平縣的樣品凈光合速率最大，其中最大值為7.32 μmol/(m2·s)。而采自曲靖市師宗縣的樣品凈光合速率最小，其值為1.38 μmol/(m2·s)。且滇西產(chǎn)地下的氣孔導(dǎo)度Gs與蒸騰速率Tr值顯著大于滇東南產(chǎn)地，而滇西產(chǎn)地的Ci/Ca值略小于滇東南產(chǎn)地，說明滇西產(chǎn)地下的樣品表現(xiàn)出比滇東南樣品更強(qiáng)的光合能力，可初步推測(cè)滇西地區(qū)相較于滇東南地區(qū)可能更適合滇重樓的生長(zhǎng)發(fā)育。

表2 不同產(chǎn)地滇重樓的光合參數(shù)

另外，通過對(duì)比不同產(chǎn)地樣品的水分利用效率也可以看出，采自大理州永平縣的樣品水分利用率最大，其值為4.88 μmol CO2/mmolH2O；而采自滇東南產(chǎn)地的樣品水分利用率低于滇西產(chǎn)地。說明滇西比滇東南具有更強(qiáng)的抗旱能力，表明滇西可能比滇東南更容易適應(yīng)生長(zhǎng)條件的變化。

2.2 相同產(chǎn)地滇重樓葉片的光響應(yīng)特征參數(shù)

為確保樣品所處環(huán)境條件一致，選取采自曲靖市師宗縣的5種滇重樓。其中師宗矮桿是源自曲靖市師宗縣的原始品種，其余品種分別來自曲靖市宣威縣、羅平縣以及紅河州瀘西縣，經(jīng)移栽種植多年性狀穩(wěn)定后采收。

由圖2可知，采自曲靖市師宗縣的原始品種師宗矮桿的凈光合速率最高，其值為4.41 μmol/(m2·s)。而經(jīng)羅平縣移栽的羅平高稈品種的凈光合速率最低，其值為1.38 μmol/(m2·s)。其余3個(gè)品種的凈光合速率均為師宗矮桿品種的50%左右。結(jié)合師宗矮桿品種的氣孔導(dǎo)度Gs與蒸騰速率Tr值均顯著大于其余4個(gè)品種，Ci/Ca值也小于其余4個(gè)品種（表3），表明師宗原始的矮桿品種可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的光合能力。

表3 相同產(chǎn)地滇重樓的光合參數(shù)

圖2 相同產(chǎn)地滇重樓葉片光響應(yīng)曲線

通過對(duì)比5個(gè)品種的水分利用效率也可以看出，采自曲靖市師宗縣的原始品種師宗矮稈品種水分利用率最大，其值為2.06 μmolCO2/mmolH2O；源自紅河州瀘西縣的瀘西矮桿品種水分利用率最低，其值為1.45 μmolCO2/mmolH2O。除宣威矮桿品種外其余3個(gè)品種均為師宗矮桿品種的50%左右。說明未經(jīng)移栽的原始品種可能具有更強(qiáng)的抗旱能力，更容易適應(yīng)本地生長(zhǎng)條件的變化。

另外，源自紅河州瀘西縣的瀘西矮桿品種與曲靖市師宗縣的原始品種師宗矮桿的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、水分利用率、Ci/Ca值上均無顯著性差異，氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率也高于源自宣威縣與羅平縣的3個(gè)品種。推測(cè)瀘西矮桿品種更容易移栽到異地生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

3.1 不同產(chǎn)地滇重樓光合作用能力

研究發(fā)現(xiàn)，滇西產(chǎn)地所產(chǎn)滇重樓的光合作用曲線高于滇東南產(chǎn)區(qū)滇重樓，尤其以大理州永平縣所產(chǎn)品種最為突出；滇西產(chǎn)地所產(chǎn)滇重樓的光合作用能力也強(qiáng)于滇東南產(chǎn)地，這可以導(dǎo)致滇西地區(qū)的滇重樓更容易積累地下生物量等有效成分。

因此可初步推測(cè)滇西地區(qū)相較于滇東南地區(qū)可能更適合滇重樓的生長(zhǎng)發(fā)育。但在滇重樓種植過程中建議參考大理州永平縣的環(huán)境條件，根據(jù)當(dāng)?shù)丨h(huán)境嚴(yán)格控制遮蔭條件，保證滇重樓在合適條件下生長(zhǎng)。

3.2 不同種源滇重樓光合作用能力

研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)移栽的曲靖市師宗縣原始品種師宗矮桿滇重樓的凈光合速率最高，氣孔導(dǎo)度Gs與蒸騰速率Tr值均顯著大于其余4個(gè)品種，Ci/Ca值也小于其余4個(gè)不同產(chǎn)地移栽后的品種，表明師宗原始的矮桿品種可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的光合能力。

因此可初步推測(cè)未經(jīng)移栽的滇重樓品種的光合作用能力優(yōu)于移栽后的品種，移栽會(huì)導(dǎo)致滇重樓各項(xiàng)光合作用指標(biāo)不同程度的降低。在移栽滇重樓的過程中，需根據(jù)原產(chǎn)地的各項(xiàng)生長(zhǎng)環(huán)境條件進(jìn)行嚴(yán)格把控，以保證滇重樓移栽后的品質(zhì)。

4 討論

通過對(duì)比不同產(chǎn)地滇重樓的光合作用曲線及參數(shù)與當(dāng)?shù)貧夂驐l件可知，來自相對(duì)寒冷干旱的滇西產(chǎn)地種植的滇重樓比環(huán)境相對(duì)潮濕的滇東南產(chǎn)地的滇重樓表現(xiàn)出更強(qiáng)的光合作用能力，在相同的CO2環(huán)境下容易積累更多的生物活性物質(zhì)。而且滇西產(chǎn)地環(huán)境的光照強(qiáng)度高于滇東南地區(qū)，降水量也低于滇東南地區(qū)。這也符合滇重樓的生長(zhǎng)習(xí)性，更有利于滇重樓的生長(zhǎng)發(fā)育。在滇西產(chǎn)地中，大理州永平縣的海拔與降水量較低，而溫度略高于滇西其他3個(gè)產(chǎn)地，所產(chǎn)滇重樓各項(xiàng)光合作用參數(shù)優(yōu)于其他產(chǎn)地所產(chǎn)品種。故大理州永平縣的環(huán)境參數(shù)對(duì)于今后滇重樓的種植具有重要的參考價(jià)值。

另外，本次試驗(yàn)選取的6個(gè)產(chǎn)地在滇重樓生長(zhǎng)過程中均采取了遮蔭措施，但經(jīng)測(cè)量后發(fā)現(xiàn)遮蔭并未達(dá)到應(yīng)有效果。大部分產(chǎn)地遮蔭后的光照強(qiáng)度依然遠(yuǎn)大于滇重樓所需的最大光照強(qiáng)度，導(dǎo)致在筆者試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)部分滇重樓出現(xiàn)副作用。因此在滇重樓種植過程中，仍需根據(jù)當(dāng)?shù)刈匀粭l件嚴(yán)格控制滇重樓生長(zhǎng)環(huán)境的光照強(qiáng)度，以免產(chǎn)生植物葉片病變導(dǎo)致減產(chǎn)。

選取曲靖市與紅河州不同品種的滇重樓移栽到曲靖市師宗縣后，移栽后的品種相較于當(dāng)?shù)仄贩N表現(xiàn)出光合作用能力低，對(duì)于水分的利用、大氣CO2的轉(zhuǎn)化能力弱。在相同的環(huán)境條件下對(duì)生物活性物質(zhì)積累的能力有可能不如未經(jīng)移栽的品種。但紅河州瀘西縣的品種與曲靖市師宗縣的品種各項(xiàng)光合參數(shù)未有顯著性差異，該產(chǎn)地品種的滇重樓有可能更適合移栽種植。后續(xù)可基于此開展對(duì)其移栽更廣泛的產(chǎn)地環(huán)境，以及其他產(chǎn)地品種移栽到不同地理環(huán)境的相關(guān)研究。為保護(hù)滇重樓的種質(zhì)資源，選擇移栽時(shí)必須廣泛采集其原產(chǎn)地的地理氣候因素，嚴(yán)格把控移栽后其生長(zhǎng)環(huán)境條件，才有可能真正做好滇重樓的種植與保護(hù)。由于試驗(yàn)選用結(jié)實(shí)期的滇重樓植株做為材料，后續(xù)需要對(duì)不同發(fā)育時(shí)期不同產(chǎn)地滇重樓的光合能力進(jìn)行探索研究，以更好地指導(dǎo)滇重樓的種植。