李吉慶 林道斌 張永杰

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)黃連-葛根藥對(duì)治療2型糖尿?。═2DM）的作用機(jī)制進(jìn)行分析。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）篩選出黃連-葛根（Coptis Chinensis-Pueraria Lobata，C-P）藥對(duì)的有效活性成分及作用靶點(diǎn)蛋白，再使用Unipro數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選出的靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為基因名，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集T2DM疾病基因，然后對(duì)藥物作用基因及疾病相關(guān)基因進(jìn)行韋恩（Venn）分析，尋找交集靶點(diǎn)，用交集靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)交集基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果：研究得到13個(gè)作用于T2DM疾病靶點(diǎn)的活性成分和146個(gè)作用靶點(diǎn)，GO功能富集分析確定了284個(gè)條目，KEGG通路分析共發(fā)現(xiàn)77條作用通路。結(jié)論：本研究結(jié)果初步探討了C-P藥對(duì)治療T2MD的基本藥理作用及其機(jī)制，并為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);黃連;葛根;2型糖尿病;作用機(jī)制;前列腺素G/H合酶1;前列腺素G/H合酶2;PI3K-Akt信號(hào)通路

Mechanisms of the Drug Pair Coptis Chinensis-Pueraria Lobata in the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus Based on Network Pharmacology

LI Jiqing，LIN Daobin，ZHANG Yongjie

（Department of Endocrine，Chinese Medicine Hospital of Hainan Province，Haikou 570203，China）

Abstract Objective：To analyze the mechanism of the drug pair Coptis chinensis-Pueraria lobata in the treatment of type 2 diabetes mellitus（T2MD）by using the method of network pharmacology.Methods：The active components and target proteins of the drug pair Coptis chinensis-Pueraria lobata（C-P）were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the target proteins were screened by Unipro database and converted into gene names.The disease gene of T2MD was collected through GeneCards database.Then the drug-acting genes and disease-related genes were analyzed by vnne to find the intersecting targets，with which plus their corresponding active components an active component-target interaction network was constructed.GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the intersecting genes were also carried out.Results：A total of 13 active components acting on T2MD and 146 effect targets were identified，284 items were identified by GO functional enrichment analysis，and 77 pathways were identified by KEGG pathway analysis.Conclusion：The results of this study preliminarily discussed the basic pharmacological effects and mechanisms of C-P drugs on the treatment of T2MD，and laid a good foundation for further experimental research.

Keywords Network pharmacology; Coptis chinensis; Pueraria lobata; Type 2 diabetes; Mechanism of action; Prostaglandin G / H synthase 1; Prostaglandin G / H synthase 2; PI3K Akt signaling pathway

中圖分類(lèi)號(hào)：R282;R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.007

作為一種常見(jiàn)的慢性疾病，糖尿病在2015年的全球發(fā)病已經(jīng)超過(guò)4.15億，預(yù)計(jì)在未來(lái)30年將達(dá)到6.42億[1]。在我國(guó)，糖尿病與心血管病以及腫瘤，已成為威脅人民健康的3大慢性病。在過(guò)去的30年里，經(jīng)過(guò)7次全國(guó)性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)內(nèi)地的糖尿病患者增長(zhǎng)了17倍，其中2型糖尿病患者占比高達(dá)90%～95%[2]。所以針對(duì)糖尿病，特別是2型糖尿病的藥物開(kāi)發(fā)已經(jīng)日益迫切。最近，由于同時(shí)具有安全性、低成本和有效性，中藥治療糖尿病受到了廣泛關(guān)注[3]，C-P藥對(duì)就是其中的代表性藥物之一。C-P藥對(duì)是經(jīng)方葛根芩連湯改善糖脂代謝的主要藥對(duì)，藥效作用等同于全方[4-5]。然而目前對(duì)于C-P藥對(duì)治療2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）的治療機(jī)制和多從單體成分或單個(gè)靶點(diǎn)展開(kāi)，與中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同治療機(jī)制相悖，這也阻礙了該藥對(duì)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，為探索中藥治病機(jī)制提供了新的方式[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)分析“分子-靶點(diǎn)-通路-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系，能從整體上闡明中藥的作用機(jī)制，從部分到系統(tǒng)的解釋中藥與機(jī)體的相互作用。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方式探討黃連治療T2DM的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 C-P藥對(duì)的活性成分及靶點(diǎn)挖掘

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）是由西北農(nóng)林科技大學(xué)依托文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫(kù)整合，能夠通過(guò)研究藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，從整體上揭示中藥的作用機(jī)制[7]。借助TCMSP在線平臺(tái)獲取C-P藥對(duì)的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18，篩選出符合條件的候選化合物其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，然后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[8]，將研究物種限定為“人”，再把獲取的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因。

1.2 T2DM相關(guān)靶點(diǎn)獲取及交集靶點(diǎn)的篩選

以“type 2 diabetes mellitus”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）中搜索T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)。并與1.1中獲取的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析，獲取交集靶點(diǎn)。

1.3 “中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

運(yùn)用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，再利用軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)的度值（Dgree）篩選出作用于T2DM的關(guān)鍵化合物及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析

再將1.2得到的交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定研究物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名設(shè)置為官方名稱(chēng)（Official Gene Symbol），根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01，進(jìn)行基因功能（Gene Ontology，GO）分析和基于京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Geomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 候選化合物及靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

在TCMSP根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，得到C-P藥對(duì)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分共15個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)去重后有210個(gè)。

2.2 T2DM靶點(diǎn)基因及交集靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因10 320個(gè)，與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析后得到交集靶點(diǎn)146個(gè)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件后，建立了一個(gè)各個(gè)節(jié)點(diǎn)聯(lián)系密切的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。見(jiàn)圖1～2。在圖中共有159個(gè)節(jié)點(diǎn)，綠色的黃連活性成分節(jié)點(diǎn)有10個(gè)、黃色的葛根活性成分節(jié)點(diǎn)有3個(gè)，紅色圓形的靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)有146個(gè)，經(jīng)過(guò)Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，得到網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（Degree）?；钚猿煞种校骄糠N活性成分對(duì)應(yīng)著21個(gè)靶點(diǎn)，度值最高的前5種活性成分分別是槲皮素（Quercetin）、黃連素（Berberine）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、芒柄花素（Formononetin）、小檗浸堿（Berlambine）等。見(jiàn)表1。靶點(diǎn)方面，Degree均值約等于2，有39個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)Degree高于均值。見(jiàn)表2。這些靶點(diǎn)能是黃連-葛根治療T2DM的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，Degree均值最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別是前列腺素G/H合酶1（PTGS1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、雄激素受體（AR）、一氧化氮合酶（NOS）。

2.4 GO功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果

利用DAVID平臺(tái)的GO和PATHWAY富集分析功能對(duì)146個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，GO富集分析中根據(jù)FDR（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）<0.01確定了284條GO條目，涉及生物過(guò)程的有216條，如對(duì)藥物反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)、細(xì)胞老化等。涉及分子功能的有60條如酶結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)活性等。涉及細(xì)胞組成的有27條，如細(xì)胞外間隙、膜筏、質(zhì)膜等。同時(shí)根據(jù)FDR<0.01共找到了77條作用通路，目前有報(bào)道的有TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。表3，表4分別列舉了FDR最小的前20條GO和KEGG通路分析結(jié)果。

3 討論

本研究共發(fā)現(xiàn)了黃連-葛根藥對(duì)的治療T2DM的13種主要活性成分及146個(gè)作用靶點(diǎn)。其中Degree值最高的5種主要成分里，槲皮素能提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的分泌，從而減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的胰島細(xì)胞凋亡[9]，并且可以增加MAPK的表達(dá)水平與促進(jìn)MAPK磷酸化，激活胰島素細(xì)胞中的FGF21/MAPK信號(hào)通路，有效減輕胰島素抵抗作用[10]。黃連素同樣具有改善胰島素抵抗作用[11]，還能調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝紊亂[12]，以及保護(hù)胰島細(xì)胞[13]。芒柄花素可以通過(guò)調(diào)控核因子-κB信號(hào)通路上游的IKKβ、IκBα，抑制二者高糖環(huán)境下的磷酸化，從而減輕由核因子-κB信號(hào)通路的活化導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[14]。有研究顯示，表小檗堿能顯著降低空腹血糖值并改善糖耐量[15]。β-谷甾醇改善微循環(huán)，對(duì)糖尿病導(dǎo)致的腎臟損害有保護(hù)作用[16]。

靶點(diǎn)方面，前列腺素G/H合酶1（PTGS1）和前列腺素G/H合酶2（PTGS2）又稱(chēng)環(huán)氧化酶（COX1/2）是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵性限速酶，COX1為結(jié)構(gòu)型同工酶，COX2為誘導(dǎo)型同工酶。COX1廣泛分布于人體的組織臟器，如胃、腎、血管等。其參與合成的前列腺素對(duì)調(diào)節(jié)腎的血流量、血管舒張起著重要作用，維持著機(jī)體的正常生理過(guò)程[17]。但COX1在T2DM的疾病過(guò)程中扮演的角色目前鮮有報(bào)道，研究主要集中在另一種亞型COX2上。由其誘導(dǎo)合成的前列腺素類(lèi)衍生物，不但會(huì)導(dǎo)致糖耐量降低，還會(huì)減弱胰島素敏感性[18-19]。因此抑制COX2的表達(dá)，進(jìn)而減少前列腺素類(lèi)物質(zhì)的合成，對(duì)治療T2DM至關(guān)重要。

一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)研究顯示總睪酮和游離睪酮水平較高者，糖尿病發(fā)病率較低[20]。進(jìn)一步的研究則表明對(duì)雄激素低下的老年患者補(bǔ)充睪酮可以有效降低空腹血糖[21]。其機(jī)制在于，線粒體功能障礙會(huì)影響到機(jī)體糖代謝過(guò)程，而睪酮可以保護(hù)線粒體從而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝作用。

PPARG是一類(lèi)由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)有3種亞型PPARα，PPARβ，PPARγ等。其中由PPARG編碼的PPARγ大量分布于脂肪細(xì)胞和免疫細(xì)胞中，從促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞分化，提高胰島素受體數(shù)目。促進(jìn)與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，加強(qiáng)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。激活與代謝相關(guān)蛋白激酶，提高外周組織細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，減少糖誘導(dǎo)的胰島素釋放等3個(gè)途徑改善胰島素抵抗。所以作用于PPARG靶點(diǎn)，可能對(duì)胰島素抵抗有改善作用[22]。

NOS3是APN信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子一氧化氮（NO）的重要合成酶。血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的NO不但可松弛血管平滑肌，還可通過(guò)抑制白細(xì)胞趨化、血小板黏附及低密度脂蛋白的過(guò)氧化，改善高糖環(huán)境下的血管損傷[23]。所以，活性成分作用于該靶點(diǎn)，可能對(duì)血管系統(tǒng)起著保護(hù)作用。

通路方面，前20條通路中目前報(bào)道與T2DM密切相關(guān)的有，乙肝通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。研究表明，乙肝患者發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于常人，這可能與乙肝病毒損傷肝功能導(dǎo)致的肝臟糖代謝異常以及進(jìn)而產(chǎn)生的胰島素抵抗有關(guān)[24-25]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，糖尿病中由其產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)在血管生成、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高糖環(huán)境下HIF-1α分子表達(dá)下調(diào)，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）低表達(dá)[26]。這也是糖尿病壞疽的發(fā)病機(jī)制之一，因?yàn)閂EGF的表達(dá)降低，會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)障礙及血管重構(gòu)受阻[27]。同時(shí)，HIF-1α直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控著抗凋亡因子Bcl-2家族中的Bcl-xL、MCL-1等[28]，糖尿病中HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)，將直接導(dǎo)致上述抗凋亡分子分泌降少，最終導(dǎo)致胰島素B細(xì)胞凋亡，這也是糖尿病發(fā)生和進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[29]。PI3K-Akt信號(hào)通路方面，激活后的PI3K，可介導(dǎo)磷脂酰肌醇一磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇二磷酸及磷脂酰肌醇三磷酸，并進(jìn)一步激活A(yù)kt?；罨腁kt對(duì)調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞數(shù)量、大小和胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄有著重要影響[30]。周琦等[31]的研究則表明葛根芩連湯可通過(guò)激活PI3K-Akt中的上游信號(hào)蛋白IRS-2，維持PI3K-Akt通路的活化，繼而產(chǎn)生保護(hù)胰島B細(xì)胞的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)C-P藥對(duì)治療T2DM的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了13種可直接作用于T2DM靶點(diǎn)的活性成分以及146個(gè)潛在靶點(diǎn)，并通過(guò)KEGG通路富集分析確定了77條作用通路，結(jié)果與目前文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合，證明了其科學(xué)性。同時(shí)上述研究成果也給我們進(jìn)一步的研究指明了方向，為在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中深入探討C-P藥對(duì)治療T2DM的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（2019-10-09收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）