唐 婕，陳健鑫，尼瑪此姆，魏玉倩，落 追，韓雨庭，呂則佳，馬煥成，伍建榕,

（1西南林業(yè)大學/云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，昆明 650224；2西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，昆明 650224）

0 引言

墨蘭(Cymbidium sinense)作為中國的名花之一，具有高貴的花形及適宜的花香，不僅觀賞價值極佳，在藥用價值、經濟價值以及食用價值等方面也有很好的前景，商業(yè)價值廣闊。然而，近年來，由于野生墨蘭的過度采挖，加之生態(tài)環(huán)境的破壞，將野生墨蘭推向了滅絕的邊緣。隨著蘭花產業(yè)化的迅猛發(fā)展，國內外市場對蘭花的需求逐步增加，而墨蘭人工栽培苗木成活率較低，影響產業(yè)化生產，主要原因是根系沒有完全菌根化，易受根腐病菌侵染。2018年云南墨江人工栽培基地墨蘭普遍出現(xiàn)根腐現(xiàn)象，發(fā)病率達60%，大量植株部分枯死或整株枯死，為明確病因，2018年5月筆者進行了實地調查及發(fā)病植株樣本采集，同時，采集原生地健壯的墨蘭根部和根際土壤，帶回實驗室進行病原菌分離鑒定和致病性測定，對原生地采集野外生長健壯的墨蘭根和土壤進行生防菌分離培養(yǎng)，以期為人工栽培墨蘭根腐病的診斷鑒定及病害綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年5月于云南墨江龍?zhí)多l(xiāng)、景星鄉(xiāng)等3個栽培基地采集墨蘭根腐病病根60株，尤以發(fā)病嚴重的為主，進行分離培養(yǎng)。

1.2 病原菌分離和培養(yǎng)

采用組織分離法分離病原真菌。選取發(fā)病典型的墨蘭根腐病病根，清水洗凈后，用滅菌的刀片切取病健交界處1.5 cm×1.5 cm大小的根部，將其放入75%的酒精浸泡10 s，0.1%升汞溶液浸泡1 min，再用無菌水漂洗5次，將多余水分用無菌濾紙片吸掉，在無菌培養(yǎng)皿中切出新面，橫置于PDA平板上，25℃暗室中培養(yǎng)5天；當菌絲長出后，用無菌接種環(huán)轉接至無菌PDA平板上純化培養(yǎng)，純菌株接種至試管斜面上，待菌落長出后置于4℃冰箱里保存?zhèn)溆肹1-4]。

1.3 病原菌致病性測定

1.3.1 離體植物致病性驗證方法 取健康墨蘭植物上的根部，用清水洗凈，75%酒精浸泡消毒10 s，蒸餾水中漂洗3次，用無菌挑針刺傷根部組織，接種病原菌菌餅（菌株25℃培養(yǎng)7天時取直徑6 mm的菌餅）后固定好，同時也采取燙傷接菌餅（直徑6 mm）方式，每種處理重復8次，以接種空白PDA菌餅處理為對照，置于25℃條件下保濕培養(yǎng)，每日記錄發(fā)病狀況。

1.3.2 整株植物致病性驗證方法 取2年生盆栽健康墨蘭幼苗，用針刺接種病原菌菌餅和噴灑病原菌懸浮液（孢子懸浮液濃度用血球計數(shù)板調節(jié)孢子液終濃度1×105個/mL）2種方法，將病原菌接種在墨蘭幼苗的根莖部后套袋保濕24 h。同時觀察記錄接種菌株的發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)僅ML6-1菌株具較強的致病性，ML2-1菌株具較輕的致病性，其他菌株無明顯致病性。

待健康墨蘭發(fā)病后再次通過組織分離法重新分離獲取病原菌，并與初始菌株進行比較[5]。

1.4 病原菌形態(tài)特征觀察

采用玻片檢視法觀察病原菌形態(tài)結構。將無菌蓋玻片斜插入培養(yǎng)基平板上，挑取純化的菌株接種于PDA平板上，25℃下培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，待菌絲長出后，用顯微鏡觀察玻片并拍照。將菌絲塊置于無菌水中培養(yǎng)，每隔24 h換一次水，在7天時挑取菌絲叢，參考《真菌分類學》，用顯微鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)特征，并初步鑒定其種類[6-7]。

1.5 病原菌的分子鑒定

以真菌基因組提取試劑盒（上海生工）提取上述分離的病原真菌基因組總DNA，以真菌18S rRNA基因通用引物(ITS1/ITS4)進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，擴增反應條件為94℃ 5 min，94℃ 40 s→55℃40 s→72℃ 30 s，30 個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物送至昆明擎科測序公司進行測序，得到序列在NCBI上進行Blast比對，選取部分同源性較高的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.6 拮抗菌的分離培養(yǎng)、篩選

采用稀釋涂布法分離根際微生物。取健康墨蘭根際土樣10 g置于三角瓶內，加入90 mL的無菌水，置于28℃搖床中180 r/min振蕩20 min。取1 mL土壤懸浮液放置試管中，加入9 mL無菌水，制成10-1g/mL菌懸液，按照此方法，獲得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL的菌懸液。取10-4、10-5、10-6g/mL的菌懸液涂布于分離培養(yǎng)基上，保持恒溫28℃培養(yǎng)24 h，用三步劃線法分離純化，并統(tǒng)一編號登記。斜面保存后，放置4℃的環(huán)境中保藏[9]。

采用平板對峙法，初步篩選能抑制墨蘭根腐病病原菌生長的拮抗細菌。取病原菌置于PDA平板中央，然后再取待測菌液接于距病原菌1.5 cm處，設不加待測菌液的PDA平板為對照組，每個處理重復3次，置于恒溫28℃環(huán)境下培養(yǎng)。5天后觀察是否出現(xiàn)抑菌帶，記錄抑菌帶大于5 mm的菌株，分別為MJ1-1、MJ7-2、MJ5-1。

采用菌絲生長速率法復篩生防菌。將上述有拮抗效果的細菌接于LB液體培養(yǎng)基中，放入搖床中150r/min保持適溫培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵菌液8000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液轉至滅菌的EP管中（用0.22 μm的微孔濾膜過濾）。將初篩拮抗菌液與PDA培養(yǎng)基按體積1:19均勻混合倒入培養(yǎng)皿中至冷卻。取病原菌置于上述PDA平板中央，設不加拮抗發(fā)酵液的PDA平板為對照組，每個處理重復3次，置于恒溫28℃環(huán)境下培養(yǎng)，5天后記錄病原菌菌落的直徑[10-13]。

1.7 拮抗菌的鑒定

1.7.1 形態(tài)鑒定 取純化后的菌株置于LB平板上，保持恒溫30℃培養(yǎng)24 h，待長出純菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、LB平板顏色等進行形態(tài)特征的鑒定。

1.7.2 基因組DNA鑒定 以細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取拮抗菌DNA，放置-20℃保存。選取16SrRNA基因通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增，PCR反應總體系為50 μL：引物27F和1492R各2 μL、10×buffer 5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶 1 μL、MgCl25 μL、蒸餾水33 μL。PCR擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 1 min，共設35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，于計算機上觀察其成像顯示結果并記錄[14]。PCR產物送至昆明擎科測序公司進行純化和測序。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

受害墨蘭根部從根基和莖基部開始發(fā)病，直至整個根部，導致根部皮層壞死，表皮與皮層分離，木質部微褐變，地上部分從苗心開始出現(xiàn)枯死癥狀（圖1）。

圖1 墨蘭人工種植多年根腐病及地上部分枯萎癥狀

2.2 分離菌株的致病性

對發(fā)病墨蘭上分離到的5株真菌進行致病性的測定，發(fā)現(xiàn)僅ML6-1菌株具致病性。以ML6-1菌株接種的離體墨蘭根部均發(fā)?。▓D2）。盆栽2年生墨蘭針刺和燙傷接種3天時根上有明顯的變色病斑，初期呈暗褐色，擴大后根部略帶凹陷，變成黃褐色；噴灑菌絲懸浮液接種5天時，根部發(fā)生變色，出現(xiàn)病斑；15天時地上部分植株出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象；30天時整株幼苗枯死，根部皮層全部出現(xiàn)腐爛癥狀（圖3）。取腐根處進行病原物的分離純化，獲得的菌株進行形態(tài)觀察和分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)與ML6-1菌株完全相同。

圖2 回接病原腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)ML6-1的發(fā)病癥狀

圖3 噴灑ML6-1菌絲懸浮液后的墨蘭發(fā)病初期

2.3 分離菌株形態(tài)學鑒定

ML6-1菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5天時，菌落呈圓形，中間凸陷，氣生菌絲白色，毛氈狀。引起墨蘭根腐病的病原為鐮刀菌一種(Fusarium sp.)，病菌的產孢組織多為分生孢子座，它的分生孢子有絲狀和長橢圓形2種類型（圖4）。當環(huán)境不利時，在腐爛的植物組織內會產生大量的厚垣孢子，細胞壁增厚在不良環(huán)境中生長[15-16]。

圖4 墨蘭典型根腐病癥狀分離菌株ML6-1的形態(tài)學特征

2.4 分離菌株分子鑒定

對ML6-1菌株基因組種擴增得到的產物進行測序，得到的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索比對，發(fā)現(xiàn)其ITS序列與GenBank中登錄號為MT529222d腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)相應序列一致性達到99%（圖5），覆蓋度達98%。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，ML6-1與ML2-1與腐皮鐮刀菌聚為一支，由此推測，造成墨江人工栽培基地墨蘭根腐病的致病菌株ML6-1為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。

圖5 采用PAUP*4.0b10MP法建立的墨蘭根腐病病原菌ITS序列的分子系統(tǒng)進化樹

2.5 拮抗菌的篩選和分離

以上述試驗分離得到的墨蘭根腐病原菌(Fusarium solani)為指示菌，以從野外墨蘭根際土壤分離得到的細菌為待測菌，將分離純化的待測菌按平板對峙法進行初篩，確定有拮抗效果的3株菌株分別為MJ1-1、MJ7-2、MJ5-1。之后將這3株菌株用發(fā)酵法進行復篩，結果顯示MJ5-1菌株的拮抗效果最強。

2.6 拮抗菌株MJ5-1的分子鑒定及16S rRNA基因的PCR擴增結果

提取菌株MJ5-1的DNA進行分子鑒定，將測序得到的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對。發(fā)現(xiàn)菌株MJ5-1與GenBank中登錄號為MK521055.1短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株的同源性達到99%。根據(jù)分類標準，可判斷屬于同一個種。結合形態(tài)可確定墨蘭根腐病的拮抗菌MJ5-1為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

試驗以細菌基因組提取試劑盒提取目的菌株的DNA，用27F和1492R引物對其進行PCR擴增，得到穩(wěn)定、清晰的條帶，擴增出的片段大小為1500 bp（圖6）。

圖6 菌株MJ1-1、MJ7-2、MJ5-1的16S rRNA電泳圖譜

2.7 拮抗菌株MJ5-1的拮抗作用分析

采用平板對峙法，研究短小芽孢桿菌MJ5-1對墨蘭根腐病原菌的拮抗作用。由表1可知，短小芽孢桿菌MJ5-1對墨蘭根腐病致病菌有較好的拮抗作用，短小芽孢桿菌對墨蘭根腐病致病菌的抑菌率均高于95%。表明短小芽孢桿菌MJ5-1是1株針對墨蘭根腐病害的高效生防菌株。MJ1-1、MJ7-2、MJ5-1在對腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)的抑菌試驗中出現(xiàn)抑菌圈，圖7是MJ5-1對病原菌的抑菌效果圖，比較抑菌圈直徑，以上3株芽孢桿菌屬菌株對腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)的抑菌效果均達到顯著性差異，其中MJ5-1差異極顯著（表1）。

圖7 拮抗菌短小芽孢桿菌MJ5-1與菌株ML6-1平板對峙結果

表1 短小芽孢桿菌對墨蘭根腐病病原真菌的抑菌直徑和抑菌率

3 討論

墨蘭根腐病是發(fā)生在云南墨江種植基地上的一種新病害，目前還未見相關報道。本研究通過對墨蘭病原菌的分離培養(yǎng)、致病性測定以及形態(tài)學鑒定和分子鑒定，確定了墨江墨蘭種植基地墨蘭根腐病的致病菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。腐皮鐮刀菌在真菌分類系統(tǒng)中屬于瘤座孢科(Tuberculariaceae)鐮刀菌屬(Fusarium)，有性階段屬于肉座菌科(Hypocreaceae)叢赤殼屬(Nectria)[17-20]。鐮刀菌屬真菌的分布非常廣泛，能侵染多種植物發(fā)生根腐病或莖腐病，嚴重影響植物的生長和產量[21-23]。比如尖孢鐮刀菌引起北京地區(qū)草莓枯萎病的發(fā)生[24]；能引起不同木薯品種不同程度的根腐病發(fā)生[25]；趙彩呈等[26]報道了重樓和白芨的根腐病及李欣等[8]報道的三七根腐病等。以上研究著重于病害癥狀以及發(fā)生規(guī)律，對病原本身的特征無相關報道。本研究首次從大棚人工栽培的墨蘭中分離致病菌，并對致病菌進行了形態(tài)學和分子學的鑒定，確定了引起墨江墨蘭人工栽培根腐病大量流行的主要病原菌是鐮刀菌屬真菌，研究了該病的發(fā)生規(guī)律，為該病害防治提供了有效的理論依據(jù)。同時，本研究還篩選出1株能高效抑制墨蘭根腐病病原菌的拮抗菌，為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)MJ5-1。該菌株分離自自然狀態(tài)的墨蘭植株根際土壤，經過檢測并無致病性，而且還具有較穩(wěn)定有效的生防保護作用。由于芽孢桿菌屬(Bacillus)對真菌的拮抗作用較好，常被作為生防菌研究報道。如周盈等[27]報道了1種枯草芽孢桿菌BSn5能產生抑菌蛋白APn5，并對胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有較好的拮抗效果，但該菌生防作用較單一；而陳瓊珍等[28]研究的枯草芽孢桿菌只對紅鐮刀菌有較好的生防作用。目前，關于芽孢桿菌的研究多見于抑制植物病害病原的生長[29]，對墨蘭根腐病病原抑菌效果鮮見報道。王英國等[30]分離到1株含抗菌多肽物質的芽孢桿菌，對尖孢鐮刀菌、毛霉和黑曲霉等多種真菌有較強的拮抗性；勾長龍等[31]發(fā)現(xiàn)1株芽孢桿菌HB-3對人參根腐病病原菌產生較強的拮抗性。同時，還有關于芽孢桿菌對柑橘綠霉病的生防作用的相關研究等。而本研究篩選了墨蘭根腐病的拮抗菌，發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)有較好的拮抗作用，是一類有效生防菌，這為墨蘭根腐病的生防措施提供了理論基礎。

本研究基于ITS序列對真菌進行分子鑒定，基于16S rRNA基因對細菌進行分子鑒定，由于物種的種屬間具有較高的相似性，核糖體基因序列過于保守而無法區(qū)分親緣關系較近的物種，要明確鐮刀菌及芽孢桿菌準確分類地位，可基于多位點序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)，如聯(lián)合分析 TUB2、LSU 及EF1-α等基因對鐮刀菌進行多序列分析，分析gyrB和rpoB對細菌做出準確的鑒定。