崔闊澍，Aftab Ahmed，Aaqil Khan，George Bawa，方清茂，李 軍，朱文濤，金 福，時健祎，彭 騰，吳茂力，肖 特,，楊文鈺

（1四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，成都 610041；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130；3四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都 610041；4成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都611137；5四川省原子能研究院，成都 610066）

0 引言

多花黃精(Polygonatum cyrtonema)是中國瀕危野生藥用植物[1-3]，四川、貴州、湖南、湖北、河南、安徽、廣西等地為主要分布區(qū)域，集藥用、食用、飼用、觀賞價值于一身，為中國三十大稀缺藥材之一[4-5]，常用根莖繁殖，由于其根莖呈連珠狀或結(jié)節(jié)成塊，習(xí)稱“種莖”[6-7]。優(yōu)良的種莖是保障中藥材生產(chǎn)的先決條件，因多花黃精人工馴化和栽培研究還處于起步階段，選種用種的科學(xué)理論還不完善，導(dǎo)致種莖質(zhì)量參差不齊，對后續(xù)藥材的生產(chǎn)及品質(zhì)產(chǎn)生很大影響，造成缺苗、弱苗、產(chǎn)量低、藥用品質(zhì)差等問題[8-11]。目前，已有學(xué)者進(jìn)行了一些研究。李世[6]于1986年5—9月中旬研究發(fā)現(xiàn)種莖長度對出苗、生長及產(chǎn)量等均有顯著影響。長度4 cm的出苗率顯著降低，長度6 cm的略低，長度8～14 cm的差別不大。楊子龍、宗燕等[12-13]發(fā)現(xiàn)，黃精根莖繁殖，每段須具2～3節(jié)，但大田當(dāng)年移栽植株越冬芽萌動遲緩，發(fā)芽率低，有的植株到第2年才發(fā)芽，并且黃精發(fā)芽時間不一致，發(fā)芽勢較低。畢勝等[14]認(rèn)為黃精需種莖繁殖，每段2～3節(jié)，長度8～12 cm。宮俊華、鄧穎連等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)不同節(jié)數(shù)黃精根莖出苗整齊度有差異，出現(xiàn)大量春發(fā)株地上部死亡情況。戴琴等[17]認(rèn)為栽培黃精需選擇健壯、顏色黃潤、無病蟲害、無破皮、具有頂芽的根莖作種。將先端幼嫩部分截成數(shù)段，每段2節(jié)，有1～3個芽眼。朱伍鳳、Arimura、Rinne、Swartz[18-21]在收獲季節(jié)選用1～2年生健壯、無病蟲害植株，挖取根狀莖，選先端幼嫩部分截成數(shù)段，每段2～3節(jié)，待切口稍晾干收漿后立即栽種，此法做得較好。但均只研究了多花黃精種莖節(jié)數(shù)，并未考慮多花黃精種莖規(guī)格和多年生年齡特性。本研究擬建立一種基于K-means聚類法，將多花黃精種莖規(guī)格和年齡進(jìn)行等級劃分，觀察多花黃精植株和塊莖的生長規(guī)律，摸清種莖規(guī)格和年齡對藥材產(chǎn)量和藥用品質(zhì)的影響，以期為科學(xué)選種用種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

種莖無病蟲害、無機(jī)械損傷，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，并由方清茂鑒定為多花黃精(Polygonatum cyrtonema)。

分析天平、電子天平(CTH-553)、紫外可見分光光度計(UV-3010)、游標(biāo)卡尺和直尺。

硫酸、蒽酮和乙醇為分析純，葡萄糖對照品（純度≥99%，批號50-99-7）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種莖K-means聚類法 K-means利用距離作為相似性指標(biāo)，先給定一個已知數(shù)據(jù)點集合X(X1,X2,X3,...,Xn)，該集包含n個d維數(shù)據(jù)點，也給定需要的聚類數(shù)目k，k由用戶指定，n個d維數(shù)據(jù)點劃分到K(K≤n)集合中，k均值算法根據(jù)某個距離函數(shù)反復(fù)把數(shù)據(jù)分入k個聚類中，從而得出組內(nèi)平方和最小，如式(1)[22]。

隨機(jī)抽取300個多花黃精種莖準(zhǔn)確測定單個種莖芽頭數(shù)、莖長、莖徑和莖質(zhì)量，作為種莖規(guī)格分級指標(biāo)，采用K-means聚類法進(jìn)行聚類分析，將種莖分為3個規(guī)格、3個年齡（見表1～2）。

表2 多花黃精種莖年齡分類標(biāo)準(zhǔn)及各年齡段種莖占比

1.2.2 田間試驗設(shè)計 試驗地點為四川省資陽市雁江區(qū)祥符鎮(zhèn)祥符村(104°29′1.29″N，30°7′56.4″E)，試驗點土壤系紅色沙壤土，2017年1月18日播種，2018年12月10日收獲。

試驗采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，主因素為種莖規(guī)格(S)，分別為一級(S1)、二級(S2)、三級(S3)；副因素為種莖年齡(A)，分別為1年生(A1)、2年生(A2)、3年生(A3)，隨機(jī)區(qū)組排列，9 個(S1A1、S1A2、S1A3、S2A1、S2A2、S2A3、S3A1、S3A2、S3A3)處理，每個處理為1個小區(qū)，小區(qū)面積81 m2(9 m×9 m)，每小區(qū)重復(fù)3次，共計27個。開溝后芽口朝上栽種，溝深度8 cm，行距30 cm，株距30 cm。每小區(qū)下種前施有機(jī)肥800 kg，后期大田管理只澆水和除草。

記錄出苗時間，出苗后10天統(tǒng)計出苗率。以1 m2小區(qū)為單位測產(chǎn)，小區(qū)內(nèi)采用“S”型5點取樣法，測定單株和單位面積產(chǎn)量。地下和地上部（莖稈和塊莖結(jié)合處為分隔點，以上為地上部，以下為地下部）在120℃殺青30 min后于70℃條件下烘干至恒重后，電子天平稱干重。

1.2.3 藥材品質(zhì)檢測 采用《中華人民共和國藥典（2015年版）》中紫外分光光度法測多花黃精藥材的多糖含量。

（1）配制對照樣品溶液。取無水葡萄糖對照品33 mg（經(jīng)105℃干燥至恒重），倒入100 mL量瓶中，加水定容至刻度，上下?lián)u勻即得（無水葡萄糖濃度為0.33 mg/mL）[2]。

（2）制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取6份對照品溶液，分別為0.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，移至10 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL刻度，搖勻，立即放入0℃冰水浴中，并緩緩滴入0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度線，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，立即取出，置0℃冰水浴中，冷卻10 min。設(shè)無對照品溶液為空白。參考紫外-可見分光光度法，582 nm波長處測吸光度值。并以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]。

（3）測定方法。稱取多花黃精藥材細(xì)粉約0.25 g（60℃干燥至恒重），置于圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，然后置水浴中加熱回流，1 h后趁熱濾過，用80%熱乙醇洗滌殘渣3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流，1 h后趁熱濾過，殘渣和燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，然后合并濾液與洗液，冷卻后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法測定吸光度值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含無水葡萄糖的質(zhì)量(mg)，后計算即得[2]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0和Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種莖規(guī)格與年齡對多花黃精出苗率的影響

從表3可以得出，多花黃精的出苗率最高達(dá)89.68%，最低為56.14%。除1年生種莖中一級和二級不存在極顯著差異，其余種莖在不同規(guī)格、年齡下的出苗均存在極顯著差異，表現(xiàn)為一級＞二級＞三級，1年生＞2年生＞3年生。由表4的相關(guān)性分析結(jié)果可知，出苗率與種莖規(guī)格、年齡間相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.875、-0.356，說明在一定范圍內(nèi)，隨著種莖規(guī)格等級的升高出苗率增高，而隨著種莖年齡的增大出苗率降低；種莖規(guī)格與年齡間交叉互作現(xiàn)象存在，但互作現(xiàn)象不明顯；各因素對出苗率貢獻(xiàn)（偏η2）由大到小表現(xiàn)為種莖規(guī)格＞種莖年齡＞種莖規(guī)格×年齡。

2.2 種莖規(guī)格與年齡對多花黃精產(chǎn)量的影響

多花黃精單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量變化較大，其中單株產(chǎn)量最大為50.16 g，最小為29.75 g；單位面積產(chǎn)量最大為489.80 g，最小為310.74 g（表3）。在不同規(guī)格、年齡下的單株產(chǎn)量和單位面積均存在極顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)價值，表現(xiàn)為一級＞二級＞三級，1年生＞2年生＞3年生。由表4的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種莖規(guī)格與單株產(chǎn)量為極顯著相關(guān)，種莖年齡與單株產(chǎn)量達(dá)到顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.910、-0.400。當(dāng)種莖規(guī)格升高時，單株產(chǎn)量增加；當(dāng)種莖年齡變大時，單株產(chǎn)量降低。種莖規(guī)格與單位面積產(chǎn)量達(dá)到極顯著相關(guān)，種莖年齡與單位面積產(chǎn)量達(dá)到顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.934、-0.410。當(dāng)種莖規(guī)格升高時，單位面積產(chǎn)量升高；當(dāng)種莖年齡變大時，單位面積產(chǎn)量降低。兩者間的交互作用同樣存在，但因互作不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)價值。偏η2顯示各因素對多花黃精單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量貢獻(xiàn)由大到小表現(xiàn)為種莖規(guī)格＞種莖年齡＞種莖規(guī)格×年齡。

表3 種莖規(guī)格與年齡多花黃精產(chǎn)量和塊莖多糖含量

表4 多花黃精種莖規(guī)格與年齡互作效應(yīng)分析

2.3 種莖規(guī)格與年齡對多花黃精藥用品質(zhì)的影響

從表1可知，多花黃精藥材多糖含量在各處理中均高于《藥典》多糖含量不低于7%的標(biāo)準(zhǔn)。多糖含量在SlA2下達(dá)到最高(10.85%)，S2A1下達(dá)到最低(7.98%)。2年生藥材多糖含量在不同規(guī)格下表現(xiàn)為最高，2年生＞3年生＞1年生。由相關(guān)性分析結(jié)果（表4）得出，多糖含量與種莖規(guī)格存在極顯著相關(guān)，與種莖年齡存在顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.605、0.397。說明在一定范圍，當(dāng)種莖規(guī)格、年齡逐漸升高時，多糖含量升高，相關(guān)性最高的是種莖規(guī)格。兩者間的交互作用明顯，具有統(tǒng)計學(xué)價值。各因素對多糖含量貢獻(xiàn)（偏η2）由大到小表現(xiàn)為種莖規(guī)格＞種莖年齡=種莖規(guī)格×年齡。

3 討論

3.1 K-means聚類分級法與種莖規(guī)格的應(yīng)用價值分析

本研究所采用的K-means聚類法，具有運(yùn)算快速、操作簡便的優(yōu)勢，時間復(fù)雜度近于線性，對大數(shù)據(jù)集有較高效率且具有可伸縮性，廣泛適用于大規(guī)模數(shù)據(jù)集[23-25]。但該法在種莖分級中也存在一定的局限性：首先，由于K-means聚類法采取均值作為等級劃分界值，分界值存在客觀誤差。在等級劃定時，一、二級的分界值一般采用一級種莖指標(biāo)的均值，以二、三級的分界值采用二級種莖指標(biāo)的均值。照此計算，一級種莖實際為指標(biāo)大于一級均值的種莖；二級種莖實際為一、二級種莖的混合，即小于一級大于二級均值的種莖；三級種莖實為二、三級的混合種莖，即小于二級大于三級均值的種莖。其次，分級指標(biāo)的設(shè)定有主觀因素。在實際操作中大多數(shù)種莖無法同時滿足莖長、莖徑和莖重3個指標(biāo)的分級要求，需要人為的選擇主要指標(biāo)（如種莖年齡）?；谝陨弦蛩?，本研究綜合比較出苗率、產(chǎn)量和藥用品質(zhì)，得出各等級種莖的優(yōu)劣順序依次為一、二、三級；一級種莖為生產(chǎn)用種為最佳，但成本高，且占比較低(27.3%)，因此，主要生產(chǎn)用種不適合；二級種莖可作為生產(chǎn)適宜用種，其占比較高(51.8%)；三級種莖在3個年齡下的田間出苗率雖然較低，可后期補(bǔ)苗，加之二、三級種莖總量占比達(dá)到72.7%，因此，作為主要生產(chǎn)用種較合適。此外，出苗率、單株產(chǎn)量和單位產(chǎn)量與種莖規(guī)格、年齡間存在相關(guān)性，在相同年齡下各等級種莖間的出苗率、單株產(chǎn)量、單位產(chǎn)量差異顯著，說明種莖分級在多花黃精科學(xué)選種用種中具有指導(dǎo)意義。

3.2 種莖年齡對產(chǎn)量和藥用品質(zhì)的影響

本研究結(jié)果顯示，種莖年齡變大，單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量降低?？赡苁欠N莖年齡變大導(dǎo)致出苗階段生長發(fā)育緩慢，后期苗弱，植物弱苗對水分、光能和養(yǎng)分的利用降低[26]，從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，不同等級的多花黃精種莖應(yīng)該存在一個年齡臨界值，在該臨界值內(nèi)，隨年齡變大單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量提高，超過臨界值后，單株產(chǎn)量將因多花黃精對水分、光能和養(yǎng)分的利用降低而下降。本試驗發(fā)現(xiàn)中在SlA2下多糖含量達(dá)到最高(10.85%)，S2A1下達(dá)到最低(7.98%)，均高于標(biāo)準(zhǔn)。在不同種莖規(guī)格下均表現(xiàn)為二年生多糖含量最高，一年生最低?？赡苁嵌嗷S精為多年生植物，種莖繁殖一般2～3年收獲，這時黃精種莖生理年齡較適宜，種莖出苗快，植株后期生長發(fā)育好，導(dǎo)致多糖積累多。劉躍鈞等[27]研究發(fā)現(xiàn)，黃精1齡級根莖，在當(dāng)年對黃精生長的前期有效促進(jìn)了黃精地上發(fā)芽。同時，肖關(guān)麗等[28]發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯生理年齡會直接影響田間出苗時間、整齊度、苗數(shù)和植株長勢等。同時，隨著種薯生理年齡的增加，馬鈴薯種薯的萌芽數(shù)、主莖數(shù)和單株結(jié)薯數(shù)增加，但平均薯重下降。另外，張曉偉等[29]在半夏種莖研究中也得出類似現(xiàn)象，半夏播種材料凈增產(chǎn)量和增重比與生理年齡有很大關(guān)系，當(dāng)種莖生理年齡增大時，增重比和增產(chǎn)量隨之降低，2年生珠芽的總生物堿含量顯著高于3年生。因此，適宜的種莖年齡能促進(jìn)藥材產(chǎn)量和藥用物質(zhì)的形成，有利于提高產(chǎn)量和藥用品質(zhì)。年齡太大或太小的種莖產(chǎn)量和品質(zhì)均有降低現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)種莖規(guī)格、年齡與出苗率相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，隨著種莖規(guī)格等級的升高出苗率增高，而隨著種莖年齡的增大出苗率降低。種莖規(guī)格與單株產(chǎn)量、單位面積產(chǎn)量極顯著相關(guān)，種莖年齡與單株產(chǎn)量、單位面積產(chǎn)量顯著相關(guān)，當(dāng)種莖規(guī)格升高時，產(chǎn)量增加；當(dāng)種莖年齡變大時，產(chǎn)量降低。種莖規(guī)格與多糖含量極顯著相關(guān)，種莖年齡與多糖含量顯著相關(guān)，在一定范圍，當(dāng)種莖規(guī)格、年齡逐漸升高時，多糖含量升高，相關(guān)性最高的是種莖規(guī)格。

綜上，推測種莖規(guī)格與年齡存在交互作用，高級、低齡多花黃精種莖適宜作種，能顯著提高多花黃精藥材產(chǎn)量和藥用品質(zhì)。