俞 蕾，謝明仁，俞發(fā)榮

（1.甘肅政法大學(xué)圖書館；2.甘肅政法大學(xué)公安分院，甘肅 蘭州 730070）

近年來，隨著脂肪酸研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。不飽和脂肪酸對(duì)于維持人體健康[2]、提高腫瘤患者的免疫功能[3]、改善營養(yǎng)狀態(tài)[4]起著重要的促進(jìn)作用。有的不飽和脂肪酸具有明顯的細(xì)胞毒性[5]。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)蛋白激酶B（PKB/Akt）活性[6]，降低P53 表達(dá)[7]，可抑制肺癌細(xì)胞增生，促進(jìn)其凋亡[8]。據(jù)甘肅省最新腫瘤登記年報(bào)報(bào)道，甘肅省腫瘤發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到240 人/10 萬，其中肺癌發(fā)病率均高于全國平均水平，其發(fā)病率和病死率一直居高不下，嚴(yán)重影響著地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，威脅著人們的身心健康。為了尋找預(yù)防和治療腫瘤的天然藥物，減輕藥物對(duì)病人的毒副作用，選用從甘肅貓兒眼（Euphorbia kansui）塊根中提取分離出的不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，UFA），給予肺癌（SHG-44）細(xì)胞，探索不飽和脂肪酸對(duì)肺癌細(xì)胞毒性作用，為不飽和脂肪酸進(jìn)一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為預(yù)防和治療肺癌探索新的作用靶點(diǎn)，提供新的藥物資源。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），蘭州大學(xué)化工學(xué)院提供；氟尿嘧啶（5-FU），武漢制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；臺(tái)盼藍(lán)、噻唑蘭、二甲基亞砜（DMSO），上海信乎生物科技有限公司；P21、P53、PKB/Akt試劑盒，SHANGHAICRTSTAL DAY BIOTECH CO.，LTD.，酶聯(lián)檢測(cè)儀，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 人肺癌細(xì)胞株（SHG-44）

甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液（2×106個(gè)/L）加入96 孔板，每孔90 μL。UFA 組：用DMSO 稀釋成0.2、0.4、0.8 mg/L 三個(gè)組，每組每孔分別加10 μL；5-FU 組：加5-FU（10 mg/L）每孔10 μL；對(duì)照組：每孔加DMSO（30 μL/L）10 μL。各組4 孔。培養(yǎng)至6、12、18、24、48 h 時(shí)各取1 板，每孔加0.4%臺(tái)盼藍(lán)10 μL，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)作圖。

1.3.2 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

培養(yǎng)48 h，每孔加噻唑蘭10 μL，培養(yǎng)4 h，每孔加二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，檢測(cè)其吸光度，計(jì)算抑制率。

1.3.3 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞分裂周期的影響

取肺癌細(xì)胞液（細(xì)胞密度為2×105個(gè)/L）加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶（含RPMI1640 培養(yǎng)液6 mL），每瓶2 mL，UFA 組分別加入0.2、0.4、0.8mg/LUFA，每瓶0.8 mL；5-FU 組：每瓶加5-FU 0.8 mL；對(duì)照組:每瓶加二甲基亞砜0.8 mL。培養(yǎng)48 h，離心，用流式細(xì)胞儀測(cè)定各期細(xì)胞數(shù)和凋亡率。

1.3.4 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞P21、P53、PKB/Akt 表達(dá)的影響

取0.2、0.4、0.8 mg/L 不飽和脂肪酸培養(yǎng)48 h 的SHG-44 細(xì)胞，按ELISA 檢測(cè)P21、P53、PKB/Akt 表達(dá)水平。

1.3.5 直線回歸方程制作

分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 加入酶標(biāo)板，在450 nm 波長下測(cè)定吸光度（OD）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度（OD）為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較用單因素方差分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞毒性作用

給予肺癌細(xì)胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU 培養(yǎng)6、12、18、24 和48 h，活細(xì)胞數(shù)依藥濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長而減少，培養(yǎng)到48 h，活細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組減少80.86%、85.75%、91.79%和86.58%，差異有顯著性（P<0.01）（圖1）。

圖1 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞毒性作用(與對(duì)照組比：＊＊P<0.01)

2.2 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用

給予肺癌細(xì)胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU培養(yǎng)48 h，MTT 法檢測(cè)，肺癌細(xì)胞增殖抑制率為50.62%、54.88%、82.36%和44.47%（圖2）。

圖2 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用(與對(duì)照組比：＊＊P<0.01)

2.3 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞分裂周期的影響

給予肺癌細(xì)胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU 培養(yǎng)48 h，G0G1 期細(xì)胞比對(duì)照組增加21.37%、30.04%、35.89%和23.39%；G2M 期細(xì)胞比對(duì)照組減少13.70%、55.40%、64.06%和51.25%；細(xì)胞凋亡率為16.34%、18.28%、21.41%和17.21%（表1）。

表1 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞分裂周期和凋亡的影響

2.4 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞P21 表達(dá)的影響

P21 直線回歸方程（圖3）。將肺癌細(xì)胞OD 代入方程，計(jì)算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組肺癌細(xì)胞P21 水平比對(duì)照組升高11.76%、26.17%、38.58%和34.48%（圖4）。

圖3 P21 標(biāo)準(zhǔn)品直線回歸方程

圖4 肺癌細(xì)胞P21 表達(dá)水平

2.5 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞P53 表達(dá)的影響

P53 直線回歸方程（圖5）。將肺癌細(xì)胞OD 代入方程，計(jì)算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組P53 水平比對(duì)照組降低17.47%、43.08%、88.11%和75.82%（圖6）。

圖5 P53 標(biāo)準(zhǔn)品直線回歸方程

圖6 肺癌細(xì)胞P53 表達(dá)水平

2.6 UFA 對(duì)肺癌細(xì)胞PKB/Akt 表達(dá)水平的影響

PKB/Akt 直線回歸方程（圖7）。將肺癌細(xì)胞OD代入方程，計(jì)算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組PKB/Akt 水平比對(duì)照組降低9.68%、19.29%、38.78%和30.76%（圖8）。

圖7 PKB/Akt 標(biāo)準(zhǔn)品直線回歸方程

圖8 肺癌細(xì)胞PKB/Akt 表達(dá)水平

3 討論

目前，癌癥治療主要采用外科、放療、化療、中醫(yī)藥及綜合治療等方法。許多研究表明，中藥配合放療、化療不但可以減輕其不良反應(yīng)，對(duì)腫瘤的療效也有明顯提高[9]。不飽和脂肪酸具有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[10]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]、轉(zhuǎn)移[12]等作用，并能抑制相關(guān)癌癥基因編碼蛋白表達(dá)[13]，調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路[14]，降低癌細(xì)胞的侵襲力[15]，起到抗腫瘤的作用。高等動(dòng)物乃至人類組織細(xì)胞的正常生長受到不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控，其中磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞分裂增殖關(guān)系尤為密切[16]。Zou 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長或抑制受PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)和控制，PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的作用，參與了許多生理和病理活動(dòng)。體外研究顯示，采用PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[18]和提高抗腫瘤藥物的藥效[19]，PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是腫瘤治療的一種有效的目標(biāo)[20]。PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在組織血管生成和細(xì)胞生長、增殖、新陳代謝、遷移、分化和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[21]。PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]；PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)[23]。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程，研究PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和參與機(jī)制及PI3K 蛋白表達(dá)，對(duì)腫瘤診斷治療和預(yù)后判斷具有一定的參考價(jià)值[24]。PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅與細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，而且在腫瘤的生長、對(duì)化療的反應(yīng)方面都扮演著重要角色，特異性抑制PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性可減少腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性[25]。Zhong 等[26]將二氫青蒿素（DHA）給予腫瘤細(xì)胞，通過抑制PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，使細(xì)胞阻滯于G0/G1 期，明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，提示PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。在PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，P53、P21 基因起著重要的調(diào)控作用。正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)外環(huán)境因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活P53基因使之表達(dá)，P53 蛋白與P21 基因直接作用調(diào)控P21 蛋白的表達(dá)，促使P21 與GDP 分離而與GTP 結(jié)合，形成P21-GTP 復(fù)合體，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)開放，細(xì)胞開始分裂和增殖；P21 具有GTP 酶活性，可水解GTP 為GDP，P21 與GDP 結(jié)合而失活，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)。綦霞等[27]對(duì)46 例首次確診的肺癌患者和23 例健康體檢者（對(duì)照組）血清中肺癌P53 等7 種抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺癌組患者抗體的陽性率明顯高于對(duì)照組。凌智君等[28]選取80例肺部疾病良性患者作為良性組，另取80 例健康人士作為對(duì)照組，對(duì)80 例非小細(xì)胞肺癌患者臨床醫(yī)學(xué)資料進(jìn)行分析對(duì)比各組血清P53 相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)。比較結(jié)果，80 例非小細(xì)胞肺癌患者中P53 陽性表達(dá)占57.5%，與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度以及腫瘤大小有關(guān)（P<0.05）。P53 抗體能夠?yàn)榉切〖?xì)胞肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度等病情的發(fā)展提供參考意義，具有較好的特異性。李慧等[29]將中藥小青龍湯給予肺癌大鼠28 d，PCR 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺細(xì)胞P53 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），肺細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。吳傳高等[30]給予肺癌H322 細(xì)胞2Gy 劑量照射后，H322 細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)水平明顯下降，G0G1 期細(xì)胞增加，G2M 期細(xì)胞明顯減少。劉玉梅等[31]利用天然活性物質(zhì)抑制PKB/Akt 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。正常的活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)，而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。若細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。MTT 法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。臺(tái)盼藍(lán)和MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予肺癌細(xì)胞不飽和脂肪酸，活細(xì)胞數(shù)依給藥濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長明顯減少，肺癌細(xì)胞抑制率顯著升高。肺癌細(xì)胞P21 水平升高，使線粒體跨膜電位降低，線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大，使細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子細(xì)胞色素C 從線粒體內(nèi)釋放出來，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PKB/Akt、P53 水平降低，抑制細(xì)胞分裂周期，G0G1期細(xì)胞明顯增加，G2M 期細(xì)胞顯著減少，肺癌細(xì)胞凋亡率升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。

綜上所述，植物提取不飽和脂肪酸對(duì)肺癌細(xì)胞具有明顯的毒性作用。其機(jī)制與不飽和脂肪酸破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，升高肺癌細(xì)胞P21 表達(dá)水平，降低PKB/Akt、P53 水平，抑制細(xì)胞分裂周期有關(guān)。P53、P21、PKB/Akt 可作為臨床肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。