覃育往，龍 瀅

(1荔波縣婦幼保健院，貴州 荔波 558499；2黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000)

0 引言

細(xì)氈毛忍冬(LonicerasimilisHemsl.)為忍冬科植物細(xì)氈毛忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，可以產(chǎn)生清熱解毒、截瘧的作用[1]?！冬F(xiàn)代中藥材鑒別手冊(cè)》“金銀花”項(xiàng)下附錄里的“地區(qū)習(xí)慣用藥”中有提到在部分地區(qū)，細(xì)氈毛忍冬的花蕾作金銀花使用[2]。在《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)里，“銀花”項(xiàng)下也收載了細(xì)氈毛忍冬，且表示細(xì)氈毛忍冬花在貴州省內(nèi)作為金銀花廣泛使用，亦為貴州省少數(shù)民族用藥，是貴州、四川等西南地區(qū)金銀花藥材的主流品種之一[3]。

研究表明，細(xì)氈毛忍冬中含有多種生理活性成分，如綠原酸、黃酮類、三萜皂苷類等。綠原酸具有保護(hù)心血管、降糖降脂、增強(qiáng)免疫力、抗菌抗病毒等藥理作用[4]。綠原酸是細(xì)氈毛忍冬產(chǎn)生清熱解毒、截瘧等作用的主要有效成分之一。目前對(duì)貴州產(chǎn)細(xì)氈毛忍冬的特征性成分研究還較少，貴州省也沒(méi)有完整的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合我省資源情況，研究采用HPLC法測(cè)定貴州產(chǎn)細(xì)氈毛忍冬中綠原酸的含量，希望能為貴州地方標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)可以為細(xì)氈毛忍冬的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1 儀器與材料

儀器：高效液相色譜儀(Ultimate300及DAD-3000檢測(cè)器)，色譜柱[Thermo Acucore XL C18(5 μm，4.6×250 mm)]，電子天平(AE-240)，數(shù)控型超聲波清洗器(KQ-500DA)，隔膜真空泵(GM-0.33A)，搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(DEY-500)。

試藥：甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)、磷酸(優(yōu)級(jí)純)、蒸餾水、綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201716，含量99.3%，供含量測(cè)定用)。

樣品：從貴陽(yáng)市貴安新區(qū)、烏當(dāng)區(qū)，畢節(jié)市和凱里市采摘，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定，均為細(xì)氈毛忍冬。其中貴安新區(qū)的分別進(jìn)行蒸曬(蒸制然后曬干)和曬干(直接曬干)處理，烏當(dāng)區(qū)的進(jìn)行曬干處理，畢節(jié)市和凱里市的進(jìn)行蒸曬處理，粉碎過(guò)四號(hào)篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

流動(dòng)相：分別比較乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液等度洗脫的效果，結(jié)果乙腈-0.4%磷酸溶液峰形最好，并根據(jù)實(shí)測(cè)考察并調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)峰分離度較好，故采用此作流動(dòng)相。

檢測(cè)波長(zhǎng)：采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在327 nm處有最大吸收且分離度和峰形較好，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

柱溫：室溫。

2.2 供試品溶液的制備

提取溶劑的考察：考慮生產(chǎn)制劑和用藥習(xí)慣，結(jié)合參照物綠原酸具有不穩(wěn)定性，提取時(shí)不能高溫、強(qiáng)光及長(zhǎng)時(shí)間加熱，難溶于三氯甲烷、乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑，易溶于甲醇、乙醇等親水性溶劑的理化性質(zhì)。考察比較了甲醇(50%)、乙醇(50%)作為提取溶劑進(jìn)行超聲處理，結(jié)果50%乙醇和50%甲醇提取的色譜信息適中、分離較好但50%甲醇峰形更好，故選擇甲醇提取。并對(duì)不同濃度甲醇(50%、60%、70%、80%、95%)進(jìn)行考察，50%～80%的甲醇提取率較高，且峰形和分離度較好，為了節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，選擇50%甲醇作為最終提取溶劑。

提取時(shí)間的考察：分別超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min進(jìn)行比較，結(jié)果超聲時(shí)間從10～60 min提取出的綠原酸含量影響不大，考慮到環(huán)境差別下可能影響提取率，確保提取完全，故選擇適中的30 min為提取時(shí)間供試品溶液的制備：取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液2 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，用50%甲醇制成39.48168 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算出供試品中綠原酸的含量(按干燥品計(jì)算)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)(專屬性試驗(yàn))

對(duì)供試品溶液采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示綠原酸目標(biāo)峰匹配度為992，表明該色譜峰是單一組分。

分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致。說(shuō)明本方法專屬性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 樣品峰純度指數(shù)匹配Fig.1 Sample peak purity index matching

圖2 綠原酸對(duì)照品圖譜Fig.2 Chromatogram of chlorogenic acid reference

圖3 細(xì)氈毛忍冬樣品圖譜Fig.3 Chromatogram of Lonicera similes Hemsl.

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密地稱取綠原酸對(duì)照品適量，用50%甲醇分別配制成4.7376 μg/mL、18.9500μg/mL、28.4260 μg/mL、47.3766 μg/mL、66.3272 μg/mL、75.8026μg/mL、94.7532 μg/mL的對(duì)照品溶液，測(cè)定，記錄綠原酸峰面積。以對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為Y=0.5304X-0.194，R2=0.9999，見(jiàn)圖4，結(jié)果表明綠原酸在4.7376～94.7532 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of chlorogenic acid

2.5.3 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸峰面積，計(jì)算峰面積的RSD=0.06%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品粉末6份0.25 g，按供試品制備方法平行處理，測(cè)定，記錄供試品中綠原酸的峰面積，計(jì)算含量，平均含量為3.8120%，RSD=0.24%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取同一供試品溶液分別在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得RSD=0.79%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品粉末(烏當(dāng)區(qū)，含量為3.8120%)0.125 g，共6份，精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(濃度為0.6016 mg/mL)8 mL，加50%甲醇42 mL，稱定重量，按供試品的制備方法從“超聲處理30 min”開(kāi)始依法處理，測(cè)定，記錄綠原酸峰面積，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。綠原酸的平均回收率為95.16%，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Recovery rate results

2.5.7 耐用性

在色譜其他條件不變的情況下，改變柱溫箱的溫度，分別考察(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)，測(cè)得含量的RSD=0.27%，表明柱溫的變化對(duì)結(jié)果基本沒(méi)有影響，故實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)室溫確定柱溫。選用色譜柱，Thermo Accucore XL C18(5 μm，4.6×250 mm)、AgilentZORBAX SB-Phenyl(5 μm，4.6×250 mm)、Waters Symmrtry C18(5 μm，4.6×150 mm)、Diamonsil C18(5 μm，4.6×250 mm)，進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得含量的RSD=0.31%，C18柱和苯基柱比較，苯基柱會(huì)改變出峰順序，且十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的柱子更為常用，故選用C18色譜柱。柱溫和不同牌子的色譜柱、不同固定相的改變，都能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)陀眯暂^好。

2.6 樣品測(cè)定

取上述5種不同樣品的粉末0.25 g，精密稱定，制備，測(cè)定，記錄綠原酸峰面積，計(jì)算樣品含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Sample determination results

3 結(jié)語(yǔ)

本方法通過(guò)測(cè)定細(xì)氈毛忍冬中綠原酸的含量能有效地控制細(xì)氈毛忍冬的質(zhì)量，為提高細(xì)氈毛忍冬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)品種均為野生品種，不同地區(qū)藥材的同種處理方法含量相差不大，進(jìn)行先蒸制后低溫曬干處理的，綠原酸含量較高，而進(jìn)行直接曬干處理的，綠原酸含量較低。建議在對(duì)細(xì)氈毛忍冬花采摘后及時(shí)進(jìn)行蒸制然后低溫干燥，而不建議直接干燥的前處理方法。