張 暉，吳雪輝，董 斌，黃永芳

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品學(xué)院；b.廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507；

油茶Camellia oleifera自2016年正式被國家列為大宗油料作物，油茶產(chǎn)量逐年增加，在種植面積、產(chǎn)油量、產(chǎn)值上均穩(wěn)步提高。在南方很多產(chǎn)區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)很快成為加快農(nóng)村經(jīng)濟調(diào)整的特色產(chǎn)業(yè)，是扶貧攻堅和鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。

近年來油茶的研究熱點主要集中在茶油抗氧化活性、皂素提升價值等方面[2]。茶粕中的茶皂素（占10%～14%）具備抗菌消炎、抗高血壓、抗?jié)B透和抑制酒精吸收等生物活性[3-4]。鑒于飼用的前提是茶皂素去除，過去有關(guān)油茶餅粕的飼用研究，一般首先通過微生物或物理化學(xué)的方法去除茶皂素[5]，然后才能進一步作飼用[6]。同時，針對油茶餅粕中多糖[7]和糖萜素[8]物質(zhì)也有相關(guān)的提取工藝及應(yīng)用研究。目前，我國每年產(chǎn)生的油茶籽在100 萬t 左右，剩余殘留的油茶籽粕產(chǎn)量為70 萬t/年[9]。如何有效利用油茶餅粕，特別是對除去了茶皂素后的油茶餅粕如何能夠更好的發(fā)揮其價值，開展一個綠色生態(tài)環(huán)保的新方向成為當(dāng)前解決餅粕去向的研究熱點。油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵用作有機肥的深度研究相對不多，常規(guī)做法是通過自然發(fā)酵處理。本研究基于前期利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、魯氏毛霉（Mucor roxianus）于不同環(huán)境溫度和油茶餅粕含水量下進行固態(tài)發(fā)酵研究；進一步分析固態(tài)發(fā)酵后油茶餅粕中養(yǎng)分變化情況，為油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵作有機肥提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

本實驗采用的菌種包括3 種霉，分別為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（簡稱木霉）、黑曲霉（Aspergillus niger）、魯氏毛霉（Mucor roxianus）（簡稱毛霉），均購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，為凍干菌種。

1.1.2 油茶餅粕

實驗用的油茶餅粕購于廣東新大地生物科技有限公司，是未脫茶皂素的餅粕。

1.2 培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)基為綜合馬玲薯培養(yǎng)基，1 L 培養(yǎng)基中含20% Potato extract（馬玲薯汁），KH2PO43 g，Vitanib B1（硫胺素）Trace 8 mg，Glucose（葡萄糖）20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH=6。

1.3 油茶餅粕去茶皂素處理

通過水提法脫去茶皂素的油茶餅粕。水提法是將油茶餅粕浸泡在pH=10，固液比1∶10 的80 ℃熱水中，12 h 后進行脫水，60 ℃烘干備用[10]。

已脫茶皂素油茶餅粕（簡稱油茶餅粕，下同）養(yǎng)分檢測[11]項的有效氮、有效磷、有效鉀結(jié)果如表1所示。

表1 已脫茶皂素油茶餅粕養(yǎng)分Table 1 Nutrients of non-saponinoil-teacake (Camellia) mg·kg-1

1.4 油茶餅粕發(fā)酵設(shè)置

油茶餅粕分裝到組培瓶中，每個組培瓶裝30.0 g材料，105 ℃下滅菌4 h（對照不作滅菌處理）。滅菌后加入無菌水以調(diào)節(jié)油茶餅粕含水量（40%、50%、60%、70%），分別接入菌體2 ml（105cfu/ml）于油茶餅粕中，將材料置于溫度設(shè)置20 ℃、30 ℃、40 ℃的人工氣候箱中，定期觀察菌體生長情況及油茶餅粕變化，每個處理3 個重復(fù)。

試驗分對照和添加菌種（毛霉、木霉和黑曲霉）處理，設(shè)置3 個溫度區(qū)間20 ℃、30 ℃、40 ℃，以及4 個含水量（40%、50%、60%、70%），試驗進行完全組合。

2 結(jié)果與分析

3.4 不同菌種在已脫茶皂素的茶粕發(fā)酵后主要養(yǎng)分變化情況

3.4.1 油茶餅粕發(fā)酵后有效氮變化

本試驗進行過程中，雖然油茶餅粕是置于封蓋的組培瓶中進行，但是由于在40 ℃時，水分仍然可以從瓶中蒸發(fā)導(dǎo)致油茶餅粕變干，菌種無法在油茶餅粕中正常生長，使得該溫度下的菌體無法正常生長，而如果在試驗過程中添加水分，將會導(dǎo)致試驗中的茶粕含水量無法達到各處理要求，所以本試驗結(jié)果不包括40 ℃的處理，此條件下可認為不適宜本方法的固態(tài)發(fā)酵。

油茶餅粕在對照以及接種毛霉、木霉和黑曲霉發(fā)酵后有效氮含量如表2所示，發(fā)酵后的有效氮含量較發(fā)酵前要高，但對照處理在20 ℃、含水量70%條件下的有效氮含量損失最多，只有821.1 mg/kg，比發(fā)酵前有效氮含量降低了29.28%。油茶餅粕在接種黑曲霉，在20 ℃、含水量60%條件下，其有效氮含量達到1 596.0 mg/kg，比發(fā)酵前油茶餅粕有效氮含量提高了74.31%，是20 ℃所有處理中，有效氮含量最高的處理，其比同溫度、含水量條件下的對照處理高94.37%。在30 ℃下，接種黑曲霉的處理在含水量40%和50%時其有效氮分別比發(fā)酵前增加83.33%和69.72%，分別比對照高56.94%、15.94%。其中黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%處理組發(fā)酵后有效氮含量為本試驗處理中有效氮含量最高。

表2 油茶餅粕固體發(fā)酵后有效氮變化?Table 2 Available nitrogen changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對有效氮進行方差分析（表3）可知，菌種、溫度、含水量顯示出極顯著差異，但互作效應(yīng)菌種×溫度、菌種×含水量和菌種×溫度×含水量差異不顯著。

表3 油茶餅粕有效氮方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 3 Analysis of available nitrogen variance and Duncan’s test between levels

從各因素水平間的鄧肯檢驗結(jié)果，黑曲霉和毛霉處理與對照之間有效氮含量差異極顯著，黑曲霉與毛霉之間差異極顯著；含水量40%、50%與70%之間的有效氮含量差異極顯著，但含水量60%與70%之間的有效氮差異不顯著；雖然溫度在40 ℃時已無法順利開展試驗，但是30 ℃和20 ℃兩個溫度組之間有效氮含量表現(xiàn)極顯著差異。從有效氮含量的分析結(jié)果來看，對于有效氮的保留和轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢組合為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%組合以及黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%組合，其在本試驗中有效氮含量分別為1 678.60、1 554.00 mg/kg，為發(fā)酵前原料有效氮含量的1.83、1.70 倍。

3.4.2 油茶餅粕發(fā)酵后有效磷比較

油茶餅粕發(fā)酵前有效磷含量為822.00 mg/kg，大部分處理的有效磷含量都高于1 000 mg/kg（表4）。其中，提高幅度較大的優(yōu)勢組合為接種毛霉和木霉處理，毛霉+溫度30 ℃+含水量50%處理組有效磷含量最高，為1 386.93 mg/kg，比油茶餅粕發(fā)酵前有效磷含量增加68.73%，次優(yōu)組合為木霉+溫度20 ℃+含水量70%以及木霉+溫度20 ℃+含水量60%組合，兩組合有效磷含量分別為1 361.83 和1 243.85 mg/kg，比發(fā)酵前增加65.67% 和51.32%，比對照高17.60%、6.10%。在30 ℃時，含水量70%條件下各處理中有效磷含量較發(fā)酵前變幅較小，其中，毛霉+溫度30 ℃+含水量70%處理組有效磷含量與同條件下黑曲霉處理組相似，其有效磷含量比發(fā)酵前只增加14.80%，為本試驗處理中有效磷含量最低處理組。

表4 油茶餅粕固體發(fā)酵后有效磷變化?Table 4 Available phosphorus changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對油茶餅粕有效磷進行方差分析（表5），菌種、含水量、菌種×溫度、菌種×含水量、溫度×含水量互作效應(yīng)有效磷差異性呈極顯著，而溫度及菌種×溫度×含水量互作效應(yīng)有效磷差異不顯著。

表5 油茶餅粕有效磷方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 5 Analysis of available phosphorus variance and Duncan’s test between levels

在溫度水平間鄧肯檢驗（表5）顯示，黑曲霉與木霉、對照處理的有效磷含量差異顯著，而對照與木霉和毛霉之間差異不顯著。從菌種因素效應(yīng)來看，均值高低排列為木霉＞對照＞毛霉＞黑曲霉，其中木霉處理后的油茶餅粕有效磷均值最高，為1 172.38 mg/kg，在對照組處理中，有效磷含量最高時條件為溫度30 ℃+含水量50%，其有效磷含量為1 240.3 mg/kg，分別比同條件下毛霉和黑曲霉處理高15%和20%。20 ℃和30 ℃之間有效磷差異不顯著。含水量50%與70%差異顯著，但40%、50%和60%之間有效磷含量差異不顯著。

3.4.3 油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀比較

油茶餅粕發(fā)酵前有效鉀含量為6 681.7 mg/kg，發(fā)酵后大部分處理的有效鉀含量均比發(fā)酵前高（表6）。其中，增加幅度較大的是木霉和黑曲霉處理組，其中處理組黑曲霉+溫度30 ℃+含水量60%的有效鉀最高，為8 509.4 mg/kg，比發(fā)酵前和同條件下對照處理分別高27.35%和28.61%，次優(yōu)處理組為木霉+溫度20 ℃+含水量50%以及黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%，有效鉀含量分別為8 313.5 和8 183.0 mg/kg，比發(fā)酵前增加24%和22%，而處理組毛霉+溫度20 ℃+含水量70%油茶餅粕有效鉀含量最低，比發(fā)酵前減少7.80%，為6 159.5 mg/kg。

表6 油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀含量?Table 6 Available potassium changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對有效鉀進行方差分析（表7）可知，菌種、含水量單因素效應(yīng)和互作效應(yīng)菌種×溫度、菌種×含水量和菌種×溫度×含水量中處理后有效鉀含量都顯示出極顯著差異，而溫度、溫度×含水量效應(yīng)差異不顯著。

表7 油茶餅粕有效鉀方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 7 Analysis of available potassium variance and Duncan’s test between levels

從菌種因素各水平間鄧肯檢驗結(jié)果來看（表7），黑曲霉、木霉與毛霉、對照之間有效鉀含量差異性顯著，而黑曲霉、木霉間有效鉀含量差異不顯著，毛霉與對照間有效鉀含量差異不顯著。對比表6有效鉀均值結(jié)果含量，黑曲霉和木霉相對于對照處理有效促進了油茶餅粕有效鉀增加。

20 ℃和30 ℃之間有效鉀含量差異性不顯著。本溫度設(shè)置水平不是油茶餅粕有效鉀起作用的因素。而從有效鉀效應(yīng)均值來看，30 ℃均值高于20 ℃。含水量50%、40%、60%與70%之間有效鉀含量差異性顯著。從表7可推出較優(yōu)組合分別為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量60%、黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%、木霉+溫度20 ℃+含水量50%、木霉+溫度30 ℃+含水量40%，油茶餅粕有效鉀含量分別較發(fā)酵前增加了27%、23%、24%、21%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

黑曲霉與毛霉在油茶餅粕發(fā)酵后其有效氮均有明顯的提高，并且黑曲霉相對優(yōu)于毛霉，而在溫度上，30 ℃效應(yīng)有效氮均值比20 ℃要高，4 個含水量中40%比其它3 個含水量更有利于發(fā)酵后有效氮的提高，其最優(yōu)組合為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%、黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%，此組合有利于黑曲霉對油茶餅粕有效氮的轉(zhuǎn)化和保留。從有效氮結(jié)果來看，黑曲霉的使用有利于油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵，其次為毛霉。

毛霉、在30 ℃下、含水量50%條件下有效磷均高于各自其它水平。關(guān)于有效磷在固態(tài)發(fā)酵過程中的變化，出現(xiàn)不同的研究結(jié)果。尹永強等[12]研究結(jié)果表明在堆肥過程中有效磷含量變化呈現(xiàn)增加的趨勢。Keeling 等[13]認為是有機物的分解產(chǎn)生了有機酸和腐殖質(zhì)，這些物質(zhì)由于具有酸性或含有大量酸性基團，從而具有較強的溶解難溶磷的能力。本試驗中菌種、溫度、含水量效應(yīng)組合顯著，結(jié)合實驗中有效磷可推出較優(yōu)組合（毛霉+30 ℃+含水量50%）。

以往的研究結(jié)果顯示在堆肥過程中速效鉀含量呈現(xiàn)增加的趨勢。油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀的結(jié)果變化中3 種真菌及對照處理中除個別處理出現(xiàn)發(fā)酵后有效鉀比發(fā)酵前稍低外，其它都比發(fā)酵前有明顯增加。結(jié)果顯示在20 ℃與30 ℃下黑曲霉與木霉對油茶餅粕發(fā)酵后有效鉀增加作用明顯，并且遠優(yōu)于對照組處理。

綜上分析，本研究選出有利于油茶餅粕發(fā)酵的菌種為黑曲霉或木霉、溫度30 ℃、油茶餅粕含水量為40%或50%時進行固態(tài)發(fā)酵利于其進一步作為有機肥應(yīng)用。

3.2 討 論

目前油茶的研究主要集中在育種、食品與化學(xué)等方面[2]，如對抗旱性油茶品種的篩選[14]，在副產(chǎn)品應(yīng)用上，研究關(guān)于果殼對Al3+和Ca2+的吸附性能[15]，但對于副產(chǎn)品之一的油茶茶粕的利用研究還是停留在以前的傳統(tǒng)認識。油茶餅粕中茶皂素的存在是限制其直接固態(tài)發(fā)酵的因素之一，未經(jīng)處理的油茶餅粕常含有12%～13%的茶皂素，關(guān)于茶皂素對微生物的抑制作用已有相關(guān)研究，黃衛(wèi)文等[16]用溶劑法提取油茶枯餅中的皂素對大腸桿菌、桔青霉等6 種真菌進行了抑菌試驗，其結(jié)果均表明具有抑制作用。茶皂素是一個經(jīng)濟價值較高的日化原料。茶皂素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌具有明顯抑制作用[17]。茶皂素的抑菌機制是通過破壞菌本的正常形態(tài)，改變細胞膜和細胞壁的透性，破壞其阻隔性，導(dǎo)致堿性磷酸酶和細胞內(nèi)容物如K+、蛋白質(zhì)外匯來實現(xiàn)[18]。因此，有必要考慮油茶餅粕在未脫茶皂素前提下作固態(tài)發(fā)酵有可能受到阻礙。同時，在本試驗中單獨用油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵作有機肥，在含水量70%時已經(jīng)使茶粕處于粘稠狀態(tài)，不利于微生物的好氧性生長，使得茶粕處于一種厭氧發(fā)酵狀態(tài)，其不利結(jié)果是使得氮元素含量損失。

前期工作中[19]已經(jīng)證明魯氏毛霉M.roxianus、哈茨木霉T.harzianum和黑曲霉A.niger3 種菌未脫茶皂素與已脫茶皂素的油茶餅粕中生長對比，經(jīng)過30 d 的觀察，結(jié)果表明3 種霉菌在未脫茶皂素油茶餅粕中起始生長較慢，其菌絲未能完全遍布到油茶餅粕，在含水量為60%和70%油茶餅粕中會出現(xiàn)黃色油狀層；然而，3 種霉菌在已脫茶皂素油茶餅粕中生長較快，其中含水量40%、50%和60%處理中菌絲均能布滿在茶粕中。油茶餅粕如果用于固態(tài)發(fā)酵有機肥，從微生物生長角度考慮[20]，應(yīng)該采用已脫茶皂素作為發(fā)酵材料。同時，由于茶皂素具有非常高的經(jīng)濟價值，茶油生產(chǎn)廠家一般也會經(jīng)過下游工廠先對油茶餅粕作茶皂素提取再作進一步利用，這也是提高油茶產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值的有效方式之一。

氮素的轉(zhuǎn)化過程涉及氨化、硝化、反硝化、揮發(fā)等共同作用，并受微環(huán)境中氧濃度的影響[21]。在通過發(fā)酵處理過程中，氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化直接影響到發(fā)酵后有效氮的含量，以及整個肥料的肥效。同時，由于傳統(tǒng)堆肥腐熟過程是涉及多種自然微生物參與的生理生化過程，而對于油茶餅粕材料來說，其蛋白質(zhì)含量偏高，氮元素高于其他堆肥材料，如果采用自然發(fā)酵方式，則需要考慮多種微生物處理下可能產(chǎn)生的臭氣。因而如果利用添加外源微生物來加速該過程，并調(diào)控堆制過程中的碳氮代謝，則可通過人為措施極大減少氮類物質(zhì)分解和臭氣的產(chǎn)生。林天杰等[22]采用雞糞和菜籽餅2 種有機肥進行好氣和好氣+厭氣2 種方式發(fā)酵稻草,各養(yǎng)分速效態(tài)含量除氮外均因發(fā)酵而增大，在堆肥的過程中出現(xiàn)氮素的損失也是堆肥過程中不可避免的結(jié)果；為減少氮的損失，趙京音等[23]通過添加微生物制劑EM 來提高堆肥中有機物質(zhì)和氮素的保留率，減少氮的氣態(tài)損失。本試驗中的油茶餅粕是在有限密閉環(huán)境中進行，對有效氮的保留起到一定的作用，試驗結(jié)果也說明人為添加菌種較其自然發(fā)酵更有利于速效態(tài)養(yǎng)分的保留和增加，關(guān)于油茶餅粕在土壤中的積累過程中對微生物菌群的影響，特別是未脫茶皂素的油茶餅粕，茶皂素的含量一般達到13%，如果將其直接作有機肥施用于田間或林地育苗，茶皂素對土壤微生物的影響還未有研究，對小苗的生長作用在未來可做進一步研究。油茶茶粕由于蛋白質(zhì)含量高，其作為有機肥應(yīng)用時也應(yīng)考慮如何與其他植物廢棄物如園林植物廢棄物在最適比例混合發(fā)酵以使土壤處于更健康狀態(tài)。本文的下一步工作將在茶粕與其它有機原料混合發(fā)酵下展開研究，以達到更好的肥效和更均衡的植物促進作用。