高桂青，江 延，王 巖，賈雨淅，李睿江，楊婉秋，盛 敬

(南昌工程學院 1.土木與建筑工程學院；2.水利與生態(tài)工程學院；3.機械與電氣工程學院，江西 南昌 330099)

近年來，重金屬水污染問題在全世界范圍內(nèi)得到了廣泛的關(guān)注，其中以銅、鎘、鉛和鉻等尤為嚴重[1]，這一現(xiàn)象已經(jīng)嚴重影響到水生生物多樣性[2-4]。研究表明，重金屬濃度超過一定范圍時，會對水生植物的生長產(chǎn)生巨大影響[5-6]，嚴重時甚至導致植物停止生長[7]。銅雖然是植物所需的微量元素之一[8]，但是過量的銅會減輕植物光合作用的能力，并對植物的葉綠體、細胞壁等細胞器造成一定的損傷[9-10]。目前，大量針對沉水植物的研究主要集中于植物對重金屬的富集和生理生化的響應[11-12]，對植物形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)的研究也日益成熟。

馬來眼子菜是我國一種常見的水生植物，主要分布在長江中、下游湖泊。隨著以種植沉水植物來治理重金屬污染的方法被越來越廣泛地使用，馬來眼子菜已經(jīng)成為重金屬污染的首選修復植物之一[13-14]。本文就馬來眼子菜受不同濃度Cu2+脅迫后形態(tài)解剖特征和細胞超微結(jié)構(gòu)的響應進行探討，為馬來眼子菜在重金屬污染水體修復的應用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用馬來眼子菜和底泥均采自鄱陽湖。馬來眼子菜選取長勢相近，無分支的頂端(葉長18±0.5 cm，4個葉片)，將表面附著物洗去。清理底泥中的雜物并混勻置于塑料小盒(長20 cm，寬13 cm，高8 cm)中，底泥厚度為6 cm，每盒種植6株植株，然后將塑料小盒置于白色圓桶(直徑44 cm，高70 cm)內(nèi)加水至68cm處進行預培養(yǎng)。兩周后向圓桶中加入不同濃度的CuSO4溶液，地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB3838—2002)中V類水Cu2+濃度為1.0mg/L，此試驗中控制Cu2+濃度分別為0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L，3.0 mg/L和4.0 mg/L。與此同時，設置一組濃度為0 mg/L的空白對照組。脅迫培養(yǎng)7 d后，用于馬來眼子菜形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2 試驗方法

形態(tài)特征觀察：于各處理組織相同高度馬來眼子菜葉片的葉脈與葉片邊緣之間切取2 mm2左右小塊，取材后用FAA固定液(50%乙醇：冰醋酸：甲醛=18∶1∶1)進行固定，通過一系列乙醇和二甲苯脫水、透明、包埋后進行番紅—固綠雙重染色，最終用中性樹脂封片，制成永久切片。將切片置于Olympus BH-2光學顯微鏡下觀察和拍照。

超微結(jié)構(gòu)觀察：于各處理組相同高度馬來眼子菜葉片的葉脈與葉片邊緣之間切取2mm2左右的小塊，用3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定。經(jīng)乙醇脫水，丙酮過渡后，用環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機上切片，切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于H7650型透射電子顯微鏡下觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對馬來眼子菜形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的影響

從圖1(a)中可以看出，馬來眼子菜葉片厚度相對較薄，整體葉片呈長條狀。葉片表面由表皮細胞緊密排列組成。表皮細胞體積相差不大，形狀為圓潤的方形。上表皮的細胞體積略大于下表皮細胞。上、下表皮排列整齊，導致馬來眼子菜的表面平整光滑。上、下表皮細胞之間主要排列著葉肉組織，由薄壁細胞組成。薄壁細胞形狀大小各不相同，但彼此之間隔膜相當明顯。結(jié)構(gòu)中僅有少量的氣室存在，所以馬來眼子菜通氣組織不發(fā)達。葉片中發(fā)現(xiàn)葉脈的存在，葉片維管束導管較小，導管彼此之間排列緊密。小導管數(shù)量較多，位置處于中央，較大的導管數(shù)量很少，分布在四周。沒有發(fā)現(xiàn)柵欄組織和海綿組織的分化。

當脅迫濃度為0.5mg/L時，馬來眼子菜的整體結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著的變化，如圖1(b)所示。說明其對低濃度重金屬有一定的耐受性。但當Cu2+濃度為1.0mg/L時，部分葉肉組織出現(xiàn)一定程度的皺縮現(xiàn)象，如圖1(c)所示。薄壁細胞的排列也開始變得混亂，形狀也開始變形，如圖1(d)所示。當脅迫濃度達到2.0mg/L時，薄壁細胞之間的擠壓更加緊密，如圖1(e)所示。當Cu2+濃度上升到3.0mg/L后，葉片相較于對照組厚度非常薄。葉脈組織所占的體積變小。葉片的表面也變得不再平整光滑。下表皮細胞的排列甚至出現(xiàn)了錯位的現(xiàn)象，如圖1(f)所示。當脅迫濃度達到4.0mg/L時，葉脈組織的小導管完全擠壓在一起，葉片內(nèi)部的物質(zhì)交換受到嚴重阻礙?？拷~脈組織的部分薄壁細胞變形嚴重，整個葉片結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)以葉脈為支點向上拱起的趨勢，如圖1(g)所示。受損嚴重的部位出現(xiàn)葉片長條狀結(jié)構(gòu)斷裂的現(xiàn)象，如圖1(h)所示。

圖1 不同濃度Cu2+對馬來眼子菜形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的影響

2.2 Cu2+對馬來眼子菜葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

從葉片整體上看，馬來眼子菜在未受到Cu2+脅迫情況下，葉綠體貼著細胞壁緊密分布，其形狀近似為長橢圓形。而線粒體分布在葉綠體四周，形狀為球形如圖2(a)所示，且數(shù)量較多。Cu2+濃度為0.5mg/L時，除葉綠體出現(xiàn)略微的變形外，細胞整體結(jié)構(gòu)變化不大，如圖2(b)所示。當Cu2+濃度為1.0mg/L時，葉綠體變形較嚴重，其內(nèi)部還有少量體積較小的淀粉粒生成，細胞壁的顏色也開始變暗，如圖2(c)所示。當Cu2+濃度為2.0mg/L時，葉綠體外膜開始損壞，已經(jīng)不能維持原本的形狀，內(nèi)部淀粉粒體積也開始變大，如圖2(d)所示。當脅迫濃度達到3.0mg/L時，部分細胞壁出現(xiàn)扭曲的現(xiàn)象，邊緣部分顏色變黑。葉綠體膜被破壞，各葉綠體之間逐漸連成一片，內(nèi)部淀粉粒的體積也明顯增大，如圖2(e)所示。而在濃度為4.0mg/L的情況下，沿細胞壁分布的葉綠體已經(jīng)完全連在一起。細胞壁厚度也變得很薄，形狀完全扭曲，如圖2(f)所示。此時，整個細胞受毒害情況十分嚴重。

圖2 不同濃度Cu2+對馬來眼子菜葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 Cu2+對馬來眼子菜葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

葉綠體受Cu2+脅迫的變化相當明顯。正常情況下，馬來眼子菜的葉綠體呈長橢圓形。內(nèi)部類囊體基粒和片層排列整齊且十分緊湊，垛疊程度較大，如圖3(a)所示。由于受到濃度為0.5mg/L的Cu2+脅迫，葉綠體產(chǎn)生輕微的變形，但整體結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，如圖3(b)所示。隨著Cu2+濃度的升高，葉綠體產(chǎn)生了兩種不同的變化。部分葉綠體開始變得彎曲或膨大，其內(nèi)部還伴隨著淀粉粒的生成，如圖3(c)所示。其余的葉綠體體積膨脹，內(nèi)部類囊體排列發(fā)生紊亂，形狀變圓，如圖3(d)所示。當脅迫濃度為2.0mg/L時，葉綠體內(nèi)部的淀粉粒數(shù)量增多，體積增大。說明此時Cu2+對葉綠體內(nèi)部的物質(zhì)運輸已經(jīng)造成了嚴重的干擾，如圖3(e)所示。當Cu2+濃度為3.0mg/L時，葉綠體外膜已經(jīng)遭到了破壞，其內(nèi)部還出現(xiàn)了大量的脂質(zhì)小球，如圖3(f)所示。說明其中的類囊體已經(jīng)開始降解，細胞器開始呈現(xiàn)出衰老或病態(tài)。有些葉綠體已經(jīng)完全變形，淀粉粒已經(jīng)占據(jù)了葉綠體的大部分體積，如圖3(g)所示。而Cu2+濃度為4.0mg/L時，葉綠體的被膜完全被破壞，造成大量的類囊體殘缺，剩余的類囊體基質(zhì)紊亂不堪，垛疊程度很小，呈現(xiàn)十分松散的狀態(tài)。葉綠體開始解體，如圖3(h)所示。

圖3 不同濃度Cu2+對馬來眼子菜葉綠體的影響

2.4 Cu2+對馬來眼子菜細胞壁超微結(jié)構(gòu)的影響

馬來眼子菜細胞壁的變化相對葉綠體較小。未受脅迫情況下，細胞壁厚度均勻，顏色較淺，形狀很規(guī)律，如圖4(a)所示。濃度為0.5mg/L時細胞壁無明顯變化，如圖4(b)所示。當濃度升高到1.0mg/L時，細胞壁僅顏色略微變深，但仍未發(fā)現(xiàn)顯著的變化，如圖4(c)所示，說明馬來眼子菜細胞壁的耐受性大于葉綠體。當Cu2+濃度升高至2.0mg/L時，細胞壁的邊緣部分明顯變暗，如圖4(d)所示，其內(nèi)部甚至發(fā)現(xiàn)部分破損，并且這一現(xiàn)象還隨著Cu2+濃度的升高愈發(fā)嚴重，如圖4(e)所示。而當Cu2+濃度為4.0mg/L時，細胞壁的厚度明顯變薄，整個細胞壁呈現(xiàn)一種波浪式的形狀，并且開始有質(zhì)壁分離的現(xiàn)象出現(xiàn)，如圖4(f)所示。

圖4 不同濃度Cu2+對馬來眼子菜細胞壁的影響

3 討論

植物葉片是抵抗太陽輻射保護葉片結(jié)構(gòu)的重要屏障[15]。馬來眼子菜為多年生沉水植物，其葉片細長柔軟較薄，這種葉片結(jié)構(gòu)能夠增加馬來眼子菜葉片的浮力，有利于植物葉片向水體上層生長[16]，同時適應水流的波動[17]。葉片內(nèi)部上、下表皮細胞相對較厚，且上表皮細胞大于下表皮細胞，其原因可能是馬來眼子菜上葉面要抵抗太陽輻射以保護葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而下葉面背光[18]。受各濃度梯度Cu2+脅迫，上下表皮細胞出現(xiàn)不同程度的變形，且表皮細胞有逐漸向中間部位擠壓的趨勢，葉片厚度變薄，這與陳小峰[16]等對菹草葉結(jié)構(gòu)研究的結(jié)論相吻合。馬來眼子菜上、下表皮細胞排列緊密，大小相當，所以表面平整光滑。由于受到重金屬的毒害，表皮細胞排列變得扭曲，體積大小發(fā)生變化，葉片的結(jié)構(gòu)表面也變得凹凸不平。

處于表皮細胞中間的是葉肉組織和葉脈組織。葉肉組織由一到兩層薄壁細胞組成，沒有發(fā)現(xiàn)海綿組織和柵欄組織的分化。薄壁細胞彼此之間排列緊密，表面圓潤光滑，所以能夠保證植物葉片能量的傳遞和物質(zhì)的交換[19]。馬來眼子菜通氣系統(tǒng)不發(fā)達，所以其氣體來源主要是水中溶解氣體和氣腔中的氣體[20]，而眼子菜葉片的氣體交換主要依靠薄壁細胞之間的間隙滲透進行，這種結(jié)構(gòu)比柵欄組織更有利于植物葉片的氣體交換[21]。受Cu2+的影響，薄壁細胞形狀發(fā)生變化，原本圓潤的細胞隔膜變得不規(guī)則。薄壁細胞彼此之間更加緊密，單雙層結(jié)構(gòu)也變成多層排列分布。這種形態(tài)的變化不利于細胞間能量的傳遞，因此Cu2+的脅迫能夠?qū)︸R來眼子菜葉片內(nèi)部的物質(zhì)交換產(chǎn)生一定的影響[22]。當Cu2+達到2.0mg/L時，結(jié)構(gòu)中觀察到氣腔體積增大的現(xiàn)象。有報道稱重金屬的脅迫能夠破壞了薄壁細胞的外層隔膜，形成更加發(fā)達的通氣組織。并且，由于葉片內(nèi)部有新的氣室產(chǎn)生，增加了葉片本身的浮力，能夠促進植物向上生長，使其葉片能夠漂浮水中以增加葉片受光面積，進而增強葉片光合作用[20]。這是植物本身對抗逆境的一種表現(xiàn)形式。

葉脈在植物葉片結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色，葉脈的存在既能增強葉片的機械性能，同時也為植物葉片的氣體運輸提供途徑[23]。馬來眼子菜維管束不是特別發(fā)達，且結(jié)構(gòu)非常簡單，由多數(shù)小導管組成，中脈相對清晰，但細胞體積很小，相比薄壁細胞排列更加密集。維管束的內(nèi)部是初生木質(zhì)部[24]，是由一些小型導管構(gòu)成。由于細胞排列十分密集，所以無法區(qū)分初生木質(zhì)部和原生木質(zhì)部。其外測是初生韌皮部，為維管束的主體結(jié)構(gòu)[25]。葉脈組織在受到低濃度Cu2+的脅迫下所發(fā)生的變化不大，但當Cu2+濃度達到3.0mg/L時，整個葉脈組織體積明顯減小，維管束向內(nèi)部收縮。細胞排列更加緊密且體積變得更小，對馬來眼子菜的氣體輸送起到了阻礙作用[26]。整體上看，馬來眼子菜葉脈組織受重金屬脅迫的影響較表皮細胞和葉肉組織小，說明葉脈的抗重金屬能力比表皮細胞和葉肉組織強[14]。

Cu2+對馬來眼子菜超微結(jié)構(gòu)的影響是多方面的，植物葉片能夠通過改變自身形態(tài)和結(jié)構(gòu)來適應外界環(huán)境的改變[27]，但外界環(huán)境脅迫能導致葉片細胞生理功能的降低[28-29]。其中葉綠體和細胞壁對Cu2+的響應尤為顯著，且葉綠體對Cu2+的敏感性高于細胞壁。而線粒體對重金屬的耐受性相對較高，原因可能是植物體要依靠線粒體呼吸作用來抵抗重金屬對其本身所造成的傷害[30]。葉綠體是植物進行光合作用最重要的細胞器，健康的葉綠體是保障植物能夠正常生長發(fā)育的基本條件。部分學者認為葉綠體也是植物受外界壓力影響最直接的細胞器[31]。本實驗中，Cu2+濃度較高的植物樣品中存在馬來眼子菜葉片失綠的現(xiàn)象，說明重金屬的脅迫能夠造成細胞葉綠素含量下降[32]。這種變化也能反映植物受重金屬毒害的程度，影響到葉綠體光合作用的進行。有研究報道葉綠體內(nèi)部類囊體的垛疊程度能夠代表葉綠素含量和葉綠素(a/b)的比值變化[33-34]。本研究中隨Cu2+濃度的升高，馬來眼子菜葉綠體內(nèi)部類囊體垛疊程度逐漸變小，說明植物葉片光抑制加強，造成光合作用效率下降[35-36]。葉綠體形狀受Cu2+的脅迫有兩種變化趨勢。部分葉綠體形狀變得彎曲或膨大，Cu2+濃度為1.0mg/L時內(nèi)部還有淀粉粒生成，而淀粉粒是由于光合作用合成的糖類運輸受到阻礙聚集形成[37]，說明此時葉綠體的物質(zhì)運輸已經(jīng)受到了影響。隨著Cu2+濃度的升高，淀粉粒的數(shù)量逐漸增多，體積也會逐漸增大，嚴重時甚至能導致物質(zhì)運輸功能完全癱瘓；還有些葉綠體在重金屬的脅迫下會逐漸擴張成球形，目的是通過增大葉綠體表面積來增強太陽光線的直接穿透和受光面積，進一步加強光合效率，從而減輕高濃度Cu2+造成的傷害[38]。Cu2+的脅迫還會造成類囊體的降解，降解產(chǎn)物的脂質(zhì)部分集結(jié)形成脂質(zhì)小球[39]。低濃度Cu2+脅迫中，脂質(zhì)小球的數(shù)量較少，但也預示著葉綠體開始衰老或出現(xiàn)病理變化[38]。Cu2+濃度越高，脂質(zhì)球體的數(shù)量越多，體積越大，葉綠體所受毒害也越嚴重。因此，很多人把脂質(zhì)球體的變化作為判斷植物葉片受損程度的標志[40]。

細胞壁是保護細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要屏障。本實驗中，馬來眼子菜細胞壁對Cu2+的耐受性較葉綠體高，說明低濃度的重金屬對細胞壁產(chǎn)生的影響相對較小。未受Cu2+脅迫時，馬來眼子菜細胞壁厚度均勻，形狀規(guī)則，顏色較淺。隨著Cu2+濃度的加大，細胞壁逐漸變形，高濃度Cu2+脅迫中，細胞壁呈現(xiàn)出波浪式的變形。另外，在濃度為2.0mg/L時，細胞壁的邊緣明顯變暗，可能是細胞分泌一種特殊的物質(zhì)，能夠包裹進入的Cu2+形成黑色沉淀并附著在細胞壁附近[41]。

4 結(jié)束語

馬來眼子菜對低濃度Cu2+具有一定的耐受性，能夠保證其正常的生長發(fā)育。但當Cu2+濃度較高時，會對馬來眼子菜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)造成嚴重的影響。其中，葉片葉肉組織和細胞葉綠體、細胞壁受重金屬毒害較為明顯。因此，葉片葉肉組織、葉綠體和細胞壁這3種結(jié)構(gòu)的變化能夠作為馬來眼子菜受重金屬脅迫響應研究的理想探針。