郭飛馬 3李 明 3王小雪 3李 飛

(1.中國空間技術(shù)研究院航天神舟生物科技集團有限公司，北京 100080；2.中國航天科技集團有限公司空間生物工程研究中心，北京 100080；3.北京市空間生物工程技術(shù)研究中心，北京 100080)

1 引言

隨著中國航天技術(shù)的不斷發(fā)展以及載人航天、深空探測等一系列空間探索任務(wù)的成功實施，特別是空間站的落成進入倒計時，為空間生命科學的飛速發(fā)展提供了良機?？臻g細胞生物學研究是空間生命科學的重要分支，研究空間環(huán)境下細胞的生物學過程及變化規(guī)律，對于探索空間特殊環(huán)境對人體系統(tǒng)的影響具有重要意義，并可為利用空間環(huán)境進行生物醫(yī)藥創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)手段。

由于空間環(huán)境的特殊性，常規(guī)的地面細胞培養(yǎng)設(shè)備不能滿足在空間飛行條件下開展細胞實驗的需求，因此，需要研制特殊的、適合空間使用的細胞培養(yǎng)裝置。

目前國際空間站中的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有BioServe、GAP-FPA、Kubik和Bioculture等細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。BCA(BioServe Culture Apparatus)主要用于懸浮細胞培養(yǎng)，它實現(xiàn)了自動氣體交換、定時取樣、手動換液和固定功能。TGAP-FPA(The Group Activation Pack-Fluid Processing Apparatus)在國際空間站中用于抗生素生產(chǎn)和細胞培養(yǎng)，由外殼、玻璃管、橡膠塞組成，利用橡膠塞的推進實現(xiàn)空間液體混合。Kubik在空間站中主要用于免疫細胞、淋巴細胞的培養(yǎng)和干細胞分化，在空間實現(xiàn)溫控和樣品冷凍。Bioculture是自動化的、在軌可操控的細胞培養(yǎng)實驗系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用獨立灌注和計算機控制液體流速體系的組合技術(shù)，完成多種細胞培養(yǎng)基輸送及維持，并實現(xiàn)了溫度控制和氣體交換。

近年來，中國科研人員在細胞空間搭載方面取得了一些研究成果:王紅暉等通過神舟六號搭載心肌細胞和原代成骨細胞，實現(xiàn)了小載荷、多細胞搭載；劉紅菊等通過神舟十號搭載小鼠成肌細胞，證實空間飛行期間骨骼肌成肌細胞增殖分化的可塑性顯著降低；陳鈺等研制的空間微流控芯片生物培養(yǎng)和分析載荷由天舟一號貨運飛船送入太空，用于研究空間微重力環(huán)境下神經(jīng)細胞與免疫細胞的相互作用。

本文研制一種適合在空間進行細胞培養(yǎng)的實驗?zāi)K，并開展地面實驗進行性能測試。

2 模塊研制

空間細胞培養(yǎng)模塊的設(shè)計需要考慮以下幾個方面:①在空間微重力條件下，氣體和液體不會自然分離，培養(yǎng)容器中的氣體將會以氣泡的形式長期存在于培養(yǎng)液中，并對細胞的生長及活性產(chǎn)生嚴重影響。因此，在空間開展細胞培養(yǎng)實驗，必需使用密閉的培養(yǎng)容器，并且在其中充滿培養(yǎng)液，不能留存空氣。在這種情況下，如何在細胞培養(yǎng)過程中，維持培養(yǎng)液中氧氣和二氧化碳含量的穩(wěn)定是一個關(guān)鍵問題。②在太空艙內(nèi)各種資源都非常有限，因此，在模塊設(shè)計上需采用小型化、集成化設(shè)計，盡可能降低模塊的重量、體積、功耗及對其他資源的需求。③為便于在軌使用，空間細胞培養(yǎng)模塊除了需滿足空間飛行對安全性、可靠性等要求外，還需盡量采用簡單可靠的培養(yǎng)方法和自動化、模塊化設(shè)計，減少對航天員操作的需求，并保證實驗結(jié)果的可靠性。

空間細胞培養(yǎng)模塊要求培養(yǎng)面積大、培養(yǎng)液體積小、密封性好，并能濕熱滅菌。本模塊采用無源設(shè)計，最大外形尺寸為130 mm×90 mm×14 mm。整體由蓋板、疏水透氣膜、主體框架、O圈、緊固件、直通魯爾接頭等部分組成(圖1)。用兩側(cè)緊固件和密封O圈對培養(yǎng)室進行密封，組裝后即可進行貼壁細胞培養(yǎng)(圖2)。其中疏水透氣膜為透明薄膜，方便進行內(nèi)外氣體交換，并可進行細胞形態(tài)觀察。

圖1 空間細胞培養(yǎng)模塊設(shè)計圖Fig.1 Design chart of space cell culture device

圖2 細胞培養(yǎng)模塊實物圖Fig.2 Physical picture of cell culture device

2.1 培養(yǎng)室設(shè)計

主體框架由聚碳酸酯(PC)制成，內(nèi)部中空尺寸為80 mm×50 mm×8 mm，主體框架兩側(cè)具有凹槽可放置O圈，結(jié)合疏水透氣膜形成內(nèi)部細胞培養(yǎng)室，容積約為30 mL。培養(yǎng)室單側(cè)培養(yǎng)表面積約為40 cm，可以進行雙側(cè)細胞培養(yǎng)，顯著增加單位面積的細胞培養(yǎng)量。當細胞在疏水透氣膜上貼壁培養(yǎng)時，可與外界進行氣體交換。疏水透氣膜具有較好的生物相容性，可以耐受濕熱滅菌條件，并可重復(fù)使用。

2.2 密封設(shè)計

培養(yǎng)室采用O圈密封，結(jié)合蓋板與緊固件加強密封效果與強度。O圈由醫(yī)用硅膠制成，具有良好的生物相容性，能耐受120℃(20 min)的滅菌條件，且密封效果好。蓋板由鋁合金制成，內(nèi)側(cè)中空透氣。為實現(xiàn)培養(yǎng)液注入與交換，培養(yǎng)室通過主體框架內(nèi)部管路與直通魯爾接頭連接，魯爾接頭即插即用，具有很好的密封效果。

3 性能測試

3.1 材料

骨肉瘤細胞(Human Osteosarcoma Cells，MG63)購買于美國模式培養(yǎng)物集存中心ATCC；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，cat.11995-065)；10%胎牛血清(Hyclone)；CCK8試劑盒(日本同仁CK04)；Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(凱基KGA202-KGA204)。

3.2 細胞培養(yǎng)和細胞活性檢測

MG63細胞調(diào)整細胞濃度為4×10個/mL，接種于6孔板中，2 mL/孔，即8×10個/孔。培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后，換用10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再加入高壓滅菌后的不同材料與MG63細胞共培養(yǎng)，同時設(shè)立陰性對照組。作用72 h、144 h后除去培養(yǎng)液和材料，用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，DPBS)清洗細胞，加入200μL含10%的CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃溫浴1 h左右，取200μL上清于96孔板中，使用酶標儀450 nm波長檢測上清液OD值。

3.3 細胞裂解和總蛋白濃度測定

細胞培養(yǎng)方法同上，作用6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后除去培養(yǎng)液和材料，用DPBS洗滌細胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細胞中加入200μL預(yù)冷的Lysis Buffer，冰上裂解60 min，期間每20 min渦旋振蕩1次，每次10 s，裂解結(jié)束后在4℃下10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新管中，并于冰上放置。

BCA試劑A與BCA試劑B按50∶1的比例配制成工作液，用移液管反復(fù)吹打，充分混勻。將標準品0，1，2，4，8，12，16，20μL加入96孔板的標準孔中，所有標準孔用標準品稀釋液補足到20μL。樣品孔加入2μL樣品后，用標準品稀釋液補足至20μL。每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30 min。利用562 nm的波長檢測OD值，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

3.4 Caspase-3活性檢測

吸取50μL含100μg蛋白的細胞或組織裂解上清，體積不足50μL用10 mmol/L PBS補足至總體積50μL(各組均采用同樣的蛋白定量進行測定和比較)，加入50μL的2×Reaction Buffer，再加入5μL Caspase-3底物，并于37℃避光孵育4 h，用酶標儀在波長405 nm測定其吸光值。

3.5 裝置細胞培養(yǎng)和總蛋白測定

MG63細胞調(diào)整細胞濃度為1×10個/mL，將1 mL細胞液與15 mL新鮮培養(yǎng)基混勻，從培養(yǎng)室邊框的管路中接種于細胞培養(yǎng)裝置一側(cè)的透氣膜上，靜置4 h。再將另外1 mL細胞液與15 mL新鮮培養(yǎng)基混勻，從培養(yǎng)室邊框的管路中接種于細胞培養(yǎng)模塊另一側(cè)的透氣膜上，并使培養(yǎng)液充滿整個培養(yǎng)裝置。設(shè)立細胞培養(yǎng)瓶組作為陰性對照。靜置培養(yǎng)3天后，從培養(yǎng)室邊框的管路中吸取培養(yǎng)基，并用DPBS洗滌細胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細胞中加入200μL預(yù)冷的Lysis Buffer，冰上靜置60 min，在靜置過程中渦旋振蕩3次，每次10 s，靜置結(jié)束后4℃10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的管中，放置在冰上待用。

蛋白裂解方法同上，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。利用3.2和3.4的方法測定模塊內(nèi)的細胞活性和Caspase-3活性。

3.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，進行

t

檢驗和方差分析，

P

＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 材料對細胞活性的影響

在組裝模塊前所有與細胞接觸的材料都應(yīng)進行生物相容性檢測。測試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。其中O圈選擇常用的硅膠、氟膠、丁晴3種材料。這些材料通過高壓滅菌與MG63細胞共培養(yǎng)72 h后，利用CCK8試劑盒檢測細胞活性，結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果可見，硅膠O圈與細胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，對細胞活力的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。而丁腈和氟膠材料的O圈與細胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，與對照組相比顯著降低細胞活力，抑制細胞生長(

P

＜0.01，

P

＜0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)與細胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，對細胞活力的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。因此組裝模塊選用了硅膠材料的O圈。

圖3 O圈材料對細胞活力的影響Fig.3 Effects of O ring materials on cell viability

圖4 魯爾接頭和主體框架材料對細胞活力的影響Fig.4 Influence of Luer junction and main frame materials on cell viability

4.2 材料對細胞凋亡的影響

在組裝模塊前所有與細胞接觸的材料進行生物相容性檢查除細胞活力檢測外，還應(yīng)檢測細胞凋亡，以期進一步觀察材料對細胞生長情況的影響。測試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。這些材料通過高壓滅菌與MG63細胞共培養(yǎng)6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后檢測Caspase-3活性。Caspase家族與真核細胞的凋亡密切相關(guān)，其中Caspase-3是其中最重要的分子之一。它是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞正常生長過程中，它以酶原形式存在于胞漿中，無表達活性。在細胞發(fā)生程序性死亡的早期，caspase-3分子被激活，裂解相應(yīng)的底物。因此Caspase-3的活性可以作為判斷細胞凋亡的指標。

結(jié)果如圖5、圖6所示。結(jié)果可見，硅膠O圈6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養(yǎng)對細胞凋亡的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)在6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養(yǎng)后對細胞凋亡的影響與對照組相比，無顯著性差異(

P

＞0.05)。說明組裝模塊選用了所有材料與細胞生物相容性好，可以用于后續(xù)組裝。

圖5 魯爾接頭對細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of Luer junction on apoptosis

圖6 硅膠O圈和主體框架材料對細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of silicone O ring and host frame materials on apoptosis

4.3 培養(yǎng)模塊細胞測試

在組裝模塊前，所有與細胞接觸的材料進行生物相容性測試后，選擇適合的材料進行整機的適應(yīng)性測試。采用T25細胞培養(yǎng)瓶和自主設(shè)計的空間細胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)MG63細胞72 h，觀察細胞形態(tài)。結(jié)果顯示細胞培養(yǎng)瓶和空間細胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)一致，細胞鋪展狀態(tài)良好，如圖7、圖8所示。

圖7 細胞培養(yǎng)瓶中細胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology in cell culture flask

圖8 空間培養(yǎng)模塊中的細胞形態(tài)Fig.8 Cell morphology in a space culture device

采用蛋白定量測定培養(yǎng)72 h后，1個空間培養(yǎng)模塊的細胞總蛋白量為5.7 mg，實驗結(jié)果顯示空間細胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)MG63細胞的總蛋白量相當于4個T25的細胞培養(yǎng)瓶收集的蛋白總量。這一結(jié)果有利于在空間環(huán)境中在同樣體積的培養(yǎng)模塊中獲得更大量的細胞樣品。

采用CCK8檢測試劑盒檢測MG63細胞在不同培養(yǎng)模塊培養(yǎng)72 h后的細胞活性，實驗結(jié)果顯示如圖9所示，表明自主設(shè)計的空間細胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)的細胞活性與細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細胞活性無顯著性差異(

P

＞0.05)。

圖9 不同培養(yǎng)裝置對細胞活力的影響Fig.9 Effects of different culture devices on cell viability

檢測MG63細胞在不同培養(yǎng)模塊培養(yǎng)72 h后的Caspase-3活性，實驗結(jié)果如圖10所示，結(jié)果表明空間細胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)的細胞凋亡與細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細胞無顯著性差異(

P

＞0.05)。細胞活力和凋亡的結(jié)果同時說明空間細胞培養(yǎng)模塊在短期的細胞培養(yǎng)中可以替代細胞培養(yǎng)瓶進行空間環(huán)境的細胞培養(yǎng)。

圖10 不同培養(yǎng)裝置對細胞凋亡的影響Fig.10 Effects of different culture devices on apoptosis

5 結(jié)論

本文設(shè)計了一種空間細胞培養(yǎng)模塊，該模塊操作簡單，密封效果好，生物相容性佳。培養(yǎng)膜疏水透氣便于細胞生長和觀察。利用此模塊培養(yǎng)MG63細胞72 h后，觀察細胞生長狀態(tài)和鋪展性良好，細胞活性和凋亡與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)瓶相比無顯著性差異。該模塊為空間體外培養(yǎng)細胞提供了便利的工具，可應(yīng)用于空間飛行和空間站的細胞培養(yǎng)研究。