劉新鋒

[摘要]目的 探討蛋白去乙?；?（HDAC9）基因?qū)χ嗵牵↙PS）誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。方法 采用LPS誘導(dǎo)HCASMC，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和Western blot方法檢測(cè)HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá);MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況;ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）含量。結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，P<0.05）、細(xì)胞活力升高（F=77.940，q=17.819，P<0.05）、凋亡率降低（F=98.321，q=15.563，P<0.05）、TNF-α與IL-1β及IL-8的含量增多（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，P<0.05）。敲低HDAC9能夠抑制細(xì)胞活力和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論 敲低HDAC9可抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC增殖及炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]組蛋白脫乙酰基酶類(lèi);基因敲低技術(shù);冠狀血管;肌細(xì)胞，平滑肌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;炎癥

[中圖分類(lèi)號(hào)]R345.61;R322.12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0260-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the protein deacetylase 9 （HDAC9） gene on lipopolysaccharide （LPS）-induced proliferation， apoptosis， and inflammatory response of human coronary artery smooth muscle cells （HCASMCs）. ?Me-thods HCASMCs were induced by LPS， and the cells were divided into blank control group， model group， negative control group， and transfection group. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of HDAC9; MTT assay and flow cytometry were used to measure cell proliferation and apoptosis; ELISA was used to mea-sure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-8 （IL-8）. ?Results Compared with the blank control group， the model group had significant increases in the mRNA and protein expression levels of HDAC9 in cells （F=91.145-185.108，q=19.403-25.646，P<0.05）， a significant increase in cell viability （F=77.940，q=17.819，P<0.05）， a significant reduction in cell apoptosis rate （F=98.321，q=15.563，P<0.05）， and significant increases in the levels of TNF-α， IL-1β， and IL-8 （F=91.145-325.808，q=10.813-15.180，P<0.05）. HDAC9 knockdown inhibited cell viability and inflammatory response and promoted cell apoptosis.

Conclusion HDAC9 knockdown can inhibit LPS-induced proliferation and inflammation of HCASMCs and promote cell apoptosis.

[KEY WORDS]histone deacetylases; gene knockdown techniques; coronary vessels; myocytes， smooth muscle; cell proli-feration; apoptosis; inflammation

冠心病是由動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引起的心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康和生命[1]。業(yè)已證實(shí)，冠心病是一種慢性炎癥性疾病[2]。有證據(jù)表明，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖和凋亡失衡是AS發(fā)展的關(guān)鍵步驟[3]。蛋白去乙?；?（HDAC9）屬于HDAC家族成員，HDAC9參與心血管疾病發(fā)生和發(fā)展[4-6]。而人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）在外界因子刺激下增殖和凋亡能夠參與AS的發(fā)病過(guò)程[7]。目前，有關(guān)HDAC9基因與HCASMC關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。因此，本文探究HDAC9基因?qū)χ嗵牵↙PS）誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，以期為冠心病的治療提供新的靶點(diǎn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）購(gòu)自美國(guó)Lifeline公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;噻唑藍(lán)（MTT）試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;二甲基亞砜購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Trizol試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司;HDAC9 siRNA及陰性對(duì)照（siRNA Control）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒及Western blot檢測(cè)所需試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;HDAC9抗體、β-actin抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCASMC復(fù)蘇后接種到含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將其放置于體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶3進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC以胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞單層融合時(shí)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組（A組，未做處理），模型組（B組，以1 mg/L的LPS處理48 h），陰性對(duì)照組（C組，轉(zhuǎn)染siRNA Control后以1 mg/L的LPS處理48 h），轉(zhuǎn)染組（D組，轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA后以1 mg/L的LPS處理48 h）。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，LPS處理HCASMC的濃度和時(shí)間參考文獻(xiàn)方法[8-9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組細(xì)胞處理48 h后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)HDAC9 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑分別提取各組HCASMC中總RNA，以RNA為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，再以cDNA為模板使用SYBR premix Ex Taq PCR Kit檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系包括：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR 10 μL，ddH2O 6 μL，避光加樣。短暫離心后放置在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，用相對(duì)定量2-△△CT法計(jì)算HDAC9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè)HDAC9蛋白的表達(dá)水平

收集各組處理48 h后HCASMC，加入適量細(xì)胞裂解液，置冰上裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行加樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，分別加入1∶500稀釋的HDAC9一抗，4 ℃過(guò)夜雜交，再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光方法顯影和定影后，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin進(jìn)行標(biāo)定，采用Image J軟件對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算各組HCASMC中HDAC9蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC接種到96孔板中，按照上述1.2.2方法分組和處理，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，48 h后向各孔細(xì)胞中分別添加20 μL 的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，棄上清液，再向細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜，放置在震蕩儀上低速振蕩10 min，待還原物充分溶解以后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值（A值）。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 處理48 h后各組HCASMC加入胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，首先加入Annexin V-FITC重懸細(xì)胞，然后加入PI染液，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min，隨機(jī)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量 各組HCASMC處理48 h后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以x2±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)各組HCASMC中HDAC9的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，P<0.05）;與模型組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)（q=13.393～20.714，P<0.05）;而模型組和陰性對(duì)照組兩組相比，細(xì)胞中HDAC9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（P均>0.05）。提示LPS能夠誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達(dá)，轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA能夠成功敲低HCASMC中HDAC9的表達(dá)。見(jiàn)圖1和表1。

2.2 敲低HDAC9表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)HCASMC活力的影響

MTT檢測(cè)的結(jié)果表明，空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的A值分別為0.35±0.03、0.56±0.04、0.55±0.04和0.41±0.03。與空白對(duì)照組相比，模型組HCASMC 的A值明顯升高（F=77.940，q=17.819，P<0.05）;與模型組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC的A值明顯降低（q=12.728、11.879，P<0.05）;而模型組和陰性對(duì)照組相比，HCASMC的A值無(wú)明顯改變（P>0.05）。提示LPS能夠提高HCASMC活力，敲低HDAC9基因表達(dá)能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力增加。

2.3 敲低HDAC9表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)HCASMC凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率分別為（6.64±0.74）%、（2.37±0.26）%、（2.56±0.28）%和（7.61±1.42）%。與空白對(duì)照組細(xì)胞相比較，模型組HCASMC凋亡率明顯降低（F=98.321，q=15.563，P<0.05）;與模型組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率明顯升高（q=19.098、18.406，P<0.05）;而模型組和陰性對(duì)照組相比較，HCASMC的凋亡率無(wú)顯著變化（P>0.05）。提示LPS可阻礙HCASMC凋亡，而敲低HDAC9基因表達(dá)能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HCASMC凋亡。見(jiàn)圖2。

2.4 敲低HDAC9基因表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌的影響

ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯升高（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，P<0.05）;與模型組和陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量均明顯降低（q=7.826～8.941，P<0.05）;而模型組和陰性對(duì)照組相比，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量無(wú)明顯變化（P>0.05）。提示LPS可誘導(dǎo)HCASMC分泌炎癥因子，而敲低HDAC9基因表達(dá)能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。見(jiàn)表2。

3 討 論

冠心病是一種慢性炎癥性疾病。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs和炎癥細(xì)胞參與冠心病的病理過(guò)程[10-15]。VSMCs的增殖失控及凋亡抑制在內(nèi)膜增厚過(guò)程中起重要作用，是冠心病的重要致病機(jī)制。大量研究結(jié)果已證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程[16-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取HCASMC為載體，以探究冠心病的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)的研究結(jié)果已顯示，體外VSMCs增殖受多種生長(zhǎng)因子的刺激，如血管緊張素Ⅱ、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、脂多糖（LPS）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF）-β和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[21-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以往研究以LPS誘導(dǎo)HCASMC進(jìn)行造模，以探究HDAC9基因?qū)PS誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)影響。本文研究結(jié)果顯示，LPS能夠上調(diào)HCASMC活力，抑制HCASMC凋亡，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8等分泌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這些結(jié)果與以往研究一致。此外，LPS能夠上調(diào)HCASMC中HDAC9基因的表達(dá)。

HDAC9基因位于染色體7p21上，該基因?qū)儆贖DAC家族，在心肌、骨骼肌、胎盤(pán)等組織中均有表達(dá)。靳洲等[26]報(bào)道，HDAC9通過(guò)促進(jìn)AS在大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死中發(fā)揮重要作用。成海鵬[27]的研究結(jié)果顯示，沉默HDAC9基因能夠促進(jìn)炎癥因子分泌及巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的累積。多項(xiàng)研究表明，HDAC9基因多態(tài)性與冠心病、AS和缺血性卒中等密切相關(guān)[28-29]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性HDAC9 siRNA敲低LPS誘導(dǎo)的HCASMC中HDAC9的表達(dá)，結(jié)果顯示，敲低HDAC9能夠部分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力升高及凋亡下調(diào)。炎癥反應(yīng)的激活能夠改變內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs生物學(xué)行為，炎癥因子可以募集更多的炎性細(xì)胞以促進(jìn)AS病變的形成[30-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低HDAC9基因

可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。提示HDAC9能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的激活抑制動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍需深入探究。

綜上所述，敲低HDAC9基因能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC增殖及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HCASMC凋亡。隨著對(duì)HDAC9基因研究的深入，相信其可能成為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病治療新的分子靶向，但HDAC9在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病中的作用機(jī)制目前尚不十分明確，有待進(jìn)一步深入探究。此外，本實(shí)驗(yàn)未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行探究尚顯不足，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)此補(bǔ)充和驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]VOLGMAN A S， PALANIAPPAN L S， AGGARWAL N T， et al. Atherosclerotic cardiovascular disease in South Asians in the United States：epidemiology， risk factors， and treatments： a scientific statement from the American heart association[J]. Circulation， 2018，138（1）：e1-e34. doi：10.1161/CIR.0000000000000580.

[2]LAWAL A O. Air particulate matter induced oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease and atherosclerosis： the role of Nrf2 and AhR-mediated pathways[J]. Toxicology Letters， 2017，270：88-95.

[3]JIANG D H， YANG Y， LI D Y. Lipopolysaccharide induced vascular smooth muscle cells proliferation： a new potential therapeutic target for proliferative vascular diseases[J]. Cell Proliferation， 2017，50（2）：e12332. doi：10.1111/cpr.12332.

[4]岳洪華，何國(guó)偉，劉曉程. 組蛋白去乙?；概c心血管疾病的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述， 2017，23（6）：1104-1108.

[5]LINO CARDENAS C L， KESSINGER C W， CHENG Y， et al. An HDAC9-MALAT1-BRG1 complex mediates smooth muscle dysfunction in thoracic aortic aneurysm[J]. Nat Commun. 2018，9（1）：1009.

[6]SHROFF N， ANDER B P， ZHAN X H， et al. HDAC9 polymorphism alters blood gene expression in patients with large vessel atherosclerotic stroke[J]. Translational Stroke Research， 2019，10（1）：19-25.

[7]LIU M， KARAGIANNIS A， SIS M， et al. THree-dimensio-nal co-cultures of human coronary artery endothelial and smooth muscle cells： a novel in-vitro experimental model of atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2017，263：e77-e78. doi：10.1016/j.atherosclerosis. 2017.06.257.

[8]李紅梅，王顯. 基于脂多糖誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎性活化的熱毒生風(fēng)型絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)細(xì)胞模型構(gòu)建[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2016，31（8）：3057-3062.

[9]李紅梅，王顯. 紫杉醇水蛭素支架涂層復(fù)合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的HCASMC炎性活化過(guò)程中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B p65及其下游炎癥因子的調(diào)控作用[J]. 中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志， 2018，10（2）：203-206，217.

[10]KOVANEN P T， BOT I. Mast cells in atherosclerotic cardiovascular disease-Activators and actions[J]. European Journal of Pharmacology， 2017，816：37-46.

[11]NORDSTRM M， PAUS B， RETTERSTL K， et al. The prevalence of metabolic risk factors of atherosclerotic cardiovascular disease in Williams syndrome， Prader-Willi syndrome， and Down syndrome[J]. Journal of Intellectual & Developmental Disability， 2016，41（3）：187-196.

[12]JIE Z Y， XIA H H， ZHONG S L， et al. The gut microbiome in atherosclerotic cardiovascular disease[J]. Nature Communications， 2017，8（1）：845.

[13]PATEL J. The gut microbiome： a novel cardio-metabolic target[J]？ Cardiovascular Research， 2019，115（9）：e82-e84.

[14]DE JONG R J， OHNMACHT C. Defining dysbiosis in inflammatory bowel disease[J]. Immunity， 2019，50（1）：8-10.

[15]KUIPERS F， DE BOER J F， STAELS B. Microbiome modulation of the host adaptive immunity through bile acid modification[J]. Cell Metabolism， 2020，31（3）：445-447.

[16]KARBASFORUSH S， NOURAZARIAN A， DARABI M， et al. Docosahexaenoic acid reversed atherosclerotic changes in human endothelial cells induced by palmitic acid in vitro[J]. Cell Biochemistry and Function， 2018，36（4）：203-211.

[17]ESCOULA Q， BELLENGER S， NARCE M， et al. Docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids prevent altered-Muc2 secretion induced by palmitic acid by alleviating endoplasmic Reticulum stress in LS174T goblet cells[J]. Nutrients， 2019，11（9）：E2179.

[18]LIU Y， YU X J， ZHAO J X， et al. The role of MUC2 mucin in intestinal homeostasis and the impact of dietary components on MUC2 expression[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2020，164：884-891

[19]METHEREL A H， REZAEI K， LACOMBE R J S， et al. Plasma unesterified eicosapentaenoic acid is converted to docosahexaenoic acid （DHA） in the liver and supplies the brain with DHA in the presence or absence of dietary DHA[J]. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell Biology of Lipids， 2021，1866（8）：158942.

[20]GOETZL E J， SCHWARTZ J B， MUSTAPIC M， et al. Altered cargo proteins of human plasma endothelial cell-derived exosomes in atherosclerotic cerebrovascular disease[J]. FASEB Journal： Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology， 2017，31（8）：3689-3694.

[21]LI W F， ZHI W B， LIU F， et al. Atractylenolide I restores HO-1 expression and inhibits Ox-LDL-induced VSMCs proli-feration， migration and inflammatory responses in vitro[J]. Experimental Cell Research， 2017，353（1）：26-34.

[22]JI Y Y， LIU J T， WANG Z D， et al. Angiotensin Ⅱ induces inflammatory response partly via toll-like receptor 4-dependent signaling pathway in vascular smooth muscle cells[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2009，23（4-6）：265-276.

[23]DAI F， JIANG T， BAO Y Y， et al. Fenofibrate improves high-fat diet-induced and palmitate-induced endoplasmic Reti-culum stress and inflammation in skeletal muscle[J]. Life Sciences， 2016，157：158-167.

[24]DU S H， DONG-FANG Q， CHEN C X， et al. Toll-like receptor 4 mediates methamphetamine-induced neuroinflammation through caspase-11 signaling pathway in astrocytes[J]. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2017，10：409.

[25]WANG X H， NORTHCUTT A L， COCHRAN T A， et al. Methamphetamine activates toll-like receptor 4 to induce central immune signaling within the ventral tegmental area and contributes to extracellular dopamine increase in the nucleus accumbens shell[J]. ACS Chemical Neuroscience， 2019，10（8）：3622-3634.

[26]靳洲，李其富，馬琳，等. HDAC9與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 臨床誤診誤治， 2017，30（1）：112-115.

[27]成海鵬. miR-182沉默HDAC9對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響及機(jī)制[D]. 衡陽(yáng)：南華大學(xué)， 2017.

[28]GUO Q X， ZHANG Y， XU J N， et al. Association between the gene polymorphisms of HDAC9 and the risk of atherosclerosis and ischemic stroke[J]. Pathology & Oncology Research， 2016，22（1）：103-107.

[29]WANG X B， HAN Y D， SABINA S， et al. HDAC9 variant Rs2107595 modifies susceptibility to coronary artery disease and the severity of coronary atherosclerosis in a Chinese Han population[J]. PLoS One， 2016，11（8）：e0160449. doi：10.1371/journal.pone.0160449.

[30]DONG Q. HDAC9 regulates ox-LDL-induced endothelial cell apoptosis by participating in inflammatory reactions[J]. Frontiers in Bioscience， 2016，21（5）：907-917.

[31]YANG D， SUN C， ZHANG J， et al. Proliferation of vascular smooth muscle cells under inflammation is regulated by NF-κB p65/microRNA-17/RB pathway activation[J]. International Journal of Molecular Medicine， 2017：43-50. doi：10.3892/ijmm.2017.3212.

[32]GORENNE I， KAVURMA M， SCOTT S， et al. Vascular smooth muscle cell senescence in atherosclerosis[J]. Cardiovascular Research， 2006，72（1）：9-17.

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