楊葉 姜國弈 金明睿 李俊潔 劉志美 陳文芳

[摘要]目的 探討脂多糖（LPS）激活的中腦膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)液對(duì)神經(jīng)元的損傷作用，以及淫羊藿素（ICT）是否能夠通過雌激素膜受體（GPER）和胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。方法 在體外原代培養(yǎng)SD大鼠中腦膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，分為對(duì)照組、LPS組、ICT+LPS組、G15+ICT+LPS組和JB-1+ICT+LPS組。混合培養(yǎng)中腦原代膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照組給予二甲基亞砜（DMSO）處理;LPS組給予LPS（0.5 mg/L）作用24 h;ICT+LPS組在加入LPS前先用ICT（10 μmol/L）預(yù)保護(hù)1 h;G15+ICT+LPS組和JB-1+ICT+LPS組分別先加入GPER特異性阻斷劑G15（1 μmol/L）和IGF-1R特異性阻斷劑JB-1（1 mg/L）作用1 h，然后加入ICT預(yù)保護(hù)1 h，再加入LPS共同作用24 h。應(yīng)用膠質(zhì)細(xì)胞上層條件性培養(yǎng)液孵育原代中腦神經(jīng)元24 h，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)神經(jīng)元活力。結(jié)果 與對(duì)照組比較，LPS組神經(jīng)元細(xì)胞活力明顯下降（F=15.88，q=10.040，P<0.01）。ICT預(yù)保護(hù)能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷（q=7.457，P<0.01），此作用可以被JB-1所阻斷（q=5.098，P<0.05）;G15預(yù)處理對(duì)ICT的神經(jīng)保護(hù)作用有阻斷趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ICT能夠通過抑制LPS誘導(dǎo)的中腦膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)元，其機(jī)制可能與IGF-1R信號(hào)途徑有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]淫羊藿素;神經(jīng)元;脂多糖類;神經(jīng)膠質(zhì);炎癥;受體，IGF1型

[中圖分類號(hào)]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0182-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the neuronal damage caused by lipopolysaccharide （LPS）-activated mesencephalon glial cell-conditioned medium and whether icaritin （ICT） can exert a neuroprotective effect via G protein-coupled estrogen receptor （GPER） and insulin-like growth factor-1 receptor （IGF-1R）.?Methods Primary mesencephalon glial cells and neurons of Sprague-Dawley rats were cultured in vitro and then divided into control group， LPS group， ICT+LPS group， G15+ICT+LPS group， and JB-1+ICT+LPS group. After the mixed culture of primary mesencephalon glial cells， the control group was treated with DMSO; the LPS group was treated with LPS （0.5 mg/L） for 24 h; the ICT+LPS group was pre-protected with ICT （10 μmol/L） for 1 h before LPS was added; the G15+ICT+LPS group and the JB-1+ICT+LPS group were pretreated with the GPER-specific antagonist G15 （1 μmol/L） and the IGF-1R-specific antagonist JB-1 （1 mg/L）， respectively， for 1 h and then pre-protected with ICT for 1 h， followed by LPS treatment for another 24 h. Primary mesencephalon neurons were incubated with the glial cell-conditioned medium for 24 h， and MTT assay was used to measure the viability of neurons.?Results Compared with the control group， the LPS group had a significant reduction in the viability of neurons （F=15.88，q=10.040，P<0.01）. ICT pre-protection significantly inhibited LPS-induced neuronal damage （q=7.457，P<0.01）， and this effect was blocked by JB-1 （q=5.098，P<0.05）. G15 pretreatment slightly but not significantly blocked the neuroprotective effect of ICT （P>0.05）.Conclusion ICT can protect neurons by inhibiting LPS-induced inflammatory response of mesencephalon glial cells， which may be associated with the IGF-1R signaling pathway.

[KEY WORDS]icaritin; neurons; lipopolysaccharides; neuroglia; inflammation; receptor， IGF type 1

帕金森病（PD）的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)[1-2]。在微環(huán)境發(fā)生變化或病理損傷以后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及補(bǔ)體1q（C1q）等能進(jìn)一步誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子，造成神經(jīng)元的損傷[3-4]。而受損的神經(jīng)元通過釋放神經(jīng)毒性因子與死亡相關(guān)的分子，例如神經(jīng)黑色素、β肽和細(xì)胞碎片，進(jìn)一步引起膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而在膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)元的損傷之間形成惡性循環(huán)[5-7]。因此，有效抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化是PD防治的有效策略。研究表明，雌激素可通過雌激素核受體（ER）、雌激素膜受體（GPER）及其與胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）信號(hào)途徑的交互作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8-10]。淫羊藿素（ICT）是提取自小檗科植物淫羊藿的一種植物雌激素，能夠與雌激素受體結(jié)合，具有抗炎、骨保護(hù)、抗癌等多種功效[11-13]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，10 μmol/L ICT能夠通過ER信號(hào)途徑，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[14]，但其抗炎神經(jīng)保護(hù)作用是否與GPER和IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)途徑有關(guān)尚不清楚。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，觀察脂多糖（LPS）激活的中腦膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)液對(duì)神經(jīng)元的損傷作用，探討ICT抗炎神經(jīng)保護(hù)作用是否與GPER和IGF-1R信號(hào)途徑有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ICT購自上海同田生物技術(shù)有限公司;LPS、GPER特異性阻斷劑G15以及IGF-1R特異性阻斷劑JB-1均購自美國Sigma公司;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自Silarbio（北京）公司;新生SD大鼠購自青島即墨大任富城畜牧有限公司。

1.2 原代膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

取新生1 d的SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液消毒，在超凈工作臺(tái)中取出其中腦組織，置于DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（冰浴）中，用槍頭將組織吹打?yàn)榫鶆蚍稚⒌募?xì)胞。離心，棄去培養(yǎng)液，加入適量含有100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（FBS）的DF12全培養(yǎng)液，置于用20 g/L多聚-D-賴氨酸（Poly D）預(yù)處理4 h以上的培養(yǎng)瓶中（培養(yǎng)瓶用高壓滅菌水清洗2～3次），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右，每隔2～3 d換液。光鏡下觀察，星形膠質(zhì)細(xì)胞緊密相連位于底層，體積較小、折光性強(qiáng)、呈圓形的小膠質(zhì)細(xì)胞在其上層。

1.3 腹側(cè)中腦神經(jīng)元培養(yǎng)

在取神經(jīng)元的前1 d，用Poly D溶液鋪滿培養(yǎng)板底部，過夜，棄掉Poly D溶液，將培養(yǎng)板用無菌水洗3次，在超凈工作臺(tái)中晾干。選取妊娠14 d左右的大鼠，麻醉后進(jìn)行全身消毒，腹側(cè)朝上擺放大鼠，用大剪刀剪開大鼠腹部皮膚及肌肉，用鑷子夾出胎鼠，用小剪刀剪斷與大鼠之間的連接，迅速放入培養(yǎng)皿中。剪開胎衣，將胎鼠放入新的培養(yǎng)皿中。剪開羊膜，去除胎盤，放入新的培養(yǎng)皿中。剪下頭顱，放入新的帶有DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（冰浴）的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用眼科鑷將頭顱皮膚及頭蓋骨撕開剝離大腦，然后將中腦與其余部分分離，去除中腦腦膜，將中腦背側(cè)去除得到蝴蝶形的中腦腹側(cè)，將中腦腹側(cè)移入新的帶有DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（冰浴）的培養(yǎng)皿中，用微量移液槍輕輕吹打組織直至細(xì)胞均勻離散，移入離心管中，以1 000 r/min離心5 min。離心完成后，用吸管將上清吸除，向離心管中加入中腦腹側(cè)神經(jīng)元培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹勻并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×109/L，之后種板。放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液，培養(yǎng)7 d后用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合接種于12孔板，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃無菌培養(yǎng)箱中，應(yīng)用高糖DMEM培養(yǎng)液（含100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS）常規(guī)培養(yǎng)。光鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行分組和加藥處理。將細(xì)胞分為對(duì)照組（A組）、LPS 組（B組）、ICT+LPS 組（C組）、G15+ICT+LPS組（D組）和JB-1+ICT+LPS組（E組）。對(duì)照組細(xì)胞給予1 μL二甲基亞砜（DMSO）處理;LPS 組細(xì)胞則加入LPS（0.5 mg/L）作用24 h;ICT+LPS 組細(xì)胞加LPS前先用ICT（10 μmol/L）預(yù)保護(hù)1 h;G15+ICT+LPS組和JB-1+ICT+LPS組細(xì)胞分別先加入G15（1 mmol/L）、JB-1（1 mg/L）作用1 h，然后加入 ICT預(yù)保護(hù)1 h，再加入 LPS 共同作用24 h。將12孔板中的條件性培養(yǎng)液（100 mL）轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)神經(jīng)元的96孔板中，作用24 h。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。棄掉96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4 h，棄掉MTT溶液，每孔加入 200 μL的DMSO，用鋁箔紙包好培養(yǎng)板避光，然后放在室溫?fù)u床上約 10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x2±s表示，多組比較首先進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），再用Tukey法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組比較，LPS組神經(jīng)元細(xì)胞活力明顯下降（F=15.88，q=10.040，P<0.01），表明中腦原代膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)液能夠明顯降低中腦原代神經(jīng)元的活力。ICT（10 μmol/L）預(yù)處理能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)中腦神經(jīng)元（q=7.457，P<0.01），此作用可以被IGF-1R特異性阻斷劑JB-1所阻斷（q=5.098，P<0.05）;而GPER特異性阻斷劑G15預(yù)處理對(duì)ICT的神經(jīng)保護(hù)作用雖有阻斷趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討 論

PD的病理特征主要表現(xiàn)為黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元變性死亡[15]。神經(jīng)炎癥一直被認(rèn)為與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[16]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)充當(dāng)免疫細(xì)胞的角色，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線，其過度激活是發(fā)生神經(jīng)炎癥的主要原因[7，17]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和TNF-α等大量釋放，進(jìn)而損傷神經(jīng)元[18]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多、分布最廣的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)、神經(jīng)元代謝和局部血液供應(yīng)等，已有研究表明其功能失調(diào)在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[19-21]。星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡可通過傳播和放大神經(jīng)炎癥反應(yīng)，充當(dāng)炎癥信號(hào)的胞間傳遞者，降低神經(jīng)元的存活率[22]。

ICT是一種黃酮類化合物，主要來源于小檗科淫羊藿屬植物，具有抗炎、抗氧化以及骨保護(hù)等功效[23-24]。已有研究表明，ICT可以通過GPER介導(dǎo)的EGFR-MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)刺激SKBr3細(xì)胞增殖[25]。本課題組在前期工作中已證實(shí)，IGF-1R參與了ICT在1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞中的神經(jīng)保護(hù)作用[26]，單獨(dú)使用GPER阻斷劑G15和IGF-1R阻斷劑JB-1并不影響小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的釋放，因此推測(cè)阻斷劑單用可能不影響神經(jīng)元的細(xì)胞活力。為探討ICT的抗炎神經(jīng)保護(hù)作用是否與GPER和IGF-1R有關(guān)，本研究利用LPS誘導(dǎo)混合培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，觀察ICT是否能夠發(fā)揮抗炎作用進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元，以及GPER特異性阻斷劑G15和IGF-1R特異性阻斷劑JB-1的阻斷作用。結(jié)果顯示，LPS處理混合培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，其條件性培養(yǎng)液能使神經(jīng)元的細(xì)胞活力明顯下降，應(yīng)用ICT預(yù)處理能明顯對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，此作用可以被JB-1所阻斷，雖然G15有一定的阻斷效果，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)報(bào)道，IGF-1R與ER共表達(dá)并參與交聯(lián)，涉及多方面的協(xié)同作用，例如，IGF-1刺激髓核細(xì)胞，能通過IGF-1R與ERα之間的相互作用調(diào)節(jié)增殖和抗炎反應(yīng)[27];淫羊藿苷刺激成骨細(xì)胞，能快速誘導(dǎo)IGF-1信號(hào)通路激活ERα和Akt，促進(jìn)成骨作用[28]。在前期工作中，本課題組應(yīng)用原代培養(yǎng)的中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞證明ICT能夠通過ER發(fā)揮其抗炎作用，應(yīng)用中腦原代小膠質(zhì)細(xì)胞證明ICT能夠通過IGF-1R和GPER發(fā)揮抗炎作用，結(jié)合本次研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)ICT的抗炎神經(jīng)保護(hù)作用可能與ER、GPER和IGF-1R等3條信號(hào)通路有關(guān)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，ICT能夠通過抑制LPS誘導(dǎo)的中腦膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)元，此作用與IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)途徑有關(guān)。本研究結(jié)果為探究ICT抗PD的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）