石巍 王俊耐 張慧芳

[摘要]目的 探討ErbB2基因沉默介導(dǎo)PI3K/Akt/eNOS信號通路對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響及機制。方法 選取對數(shù)生長期人卵巢癌細胞株HO8910細胞分為5組：空白對照組（不轉(zhuǎn)染任何序列）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒）、siErbB2組（轉(zhuǎn)染siRNA序列）、wortmannin組（轉(zhuǎn)染PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制劑wortmannin）、siErbB2+IGF-1組（轉(zhuǎn)染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信號通路激動劑IGF-1）。采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot檢測ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平，同時檢測細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的變化。結(jié)果 與空白對照組比較，siErbB2組和wortmannin組卵巢癌細胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量顯著下降，而Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達量則顯著增加（F=3.58～8.69，P均<0.05），細胞增殖能力、侵襲能力、遷移能力均顯著下降（F=8.84～15.67，P均<0.05），細胞凋亡率上升（F=9.46，P<0.05）;siErbB2組ErbB2表達明顯下降（P<0.05）。與siErbB2組相比，siErbB2+IGF-1組ErbB2、Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量顯著下降（P均<0.05），Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達量顯著增加（P均<0.05），細胞增殖能力、侵襲能力、遷移能力均明顯下降（P均<0.05），細胞凋亡率上升（P<0.05）。結(jié)論 ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路，從而抑制卵巢癌細胞增殖，促進細胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信號通路激活可逆轉(zhuǎn)ErbB2基因沉默作用，促進卵巢癌細胞增殖并抑制細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]基因，erbB-2;基因沉默;PI3K/Akt/eNOS信號通路;卵巢腫瘤;細胞增殖;細胞凋亡;細胞運動;腫瘤侵潤

[中圖分類號]R737.31;R394.3

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0222-06

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ErbB2 gene silencing on the biological characteristics of ovarian cancer cells by mediating the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway and its mechanism.

Methods Human ovarian cancer HO8910 cells in the logarithmic growth phase were divided into blank control group （without transfection of any sequence）， negative control group （transfected with empty vector plasmid）， siErbB2 group （transfected with siRNA sequence）， wortmannin group （transfected with the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway inhibitor wortmannin）， and siErbB2+IGF-1 group （transfected with siRNA sequence and the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway agonist IGF-1）. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， Caspase-3， Bax， and Bcl-2， and the changes in cell proliferation， apoptosis， migration， and invasion were observed.?Results Compared with the blank control group， the siErbB2 group and the wortmannin group had significant reductions in the mRNA and protein expression levels of Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 and significant increases in the mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax in ova-rian cancer cells （F=3.58-8.69，P<0.05）， as well as significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （F=8.84-15.67， all P<0.05） and a significant increase in cell apoptotic rate （F=9.46，P<0.05）; the siErbB2 group had a significant reduction in the expression of ErbB2 （P<0.05）. Compared with the siErbB2 group， the siErbB2+IGF-1 group had signi-ficant reductions in the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 （all P<0.05）， significant increases in the mRNA and protein expression of Caspase-3 and Bax （all P<0.05）， significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （all P<0.05）， and a significant increase in cell apoptotic rate （P<0.05）.?Conclusion ErbB2 gene silencingcan inhibit the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway， thereby inhibiting the proliferation of ovarian cancer cells and promoting cell apoptosis. The activation of the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway can reverse the effect of ErbB2 gene silencing， promote the proli-feration of ovarian cancer cells， and inhibit cell apoptosis.

[KEY WORDS]genes， erbB2; gene silencing; PI3K/Akt/eNOS signaling pathway; ovarian neoplasms; cell proliferation; apoptosis; cell movement; neoplasm invasiveness

卵巢癌作為一種常見女性惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，病死率高[1]。而卵巢癌以化療為主的治療手段因耐藥性其效果不容樂觀[2]。故有必要通過對卵巢癌發(fā)病機制的探究，尋找新型的腫瘤治療方法。ErbB2基因又稱HER2，隸屬于表皮生長因子受體家族[3]。ErbB2基因常高表達于腫瘤細胞中[4]，而且PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活性較高[5]，導(dǎo)致腫瘤細胞惡性程度極高，提示腫瘤病人轉(zhuǎn)移率高、存活期縮短。而PI3K/Akt/eNOS信號通路是一種經(jīng)典的抗細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該通路異常已被證實在眾多惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及放化療抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。PI3K抑制劑可有效抑制癌細胞增殖從而促進細胞凋亡，進而發(fā)揮腫瘤治療作用[8]。然而，目前關(guān)于ErbB2基因是否影響卵巢癌細胞生物學(xué)特性以及其與PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)的機制的研究未見報道。因此，本研究期望通過基因沉默技術(shù)，探究ErbB2基因沉默介導(dǎo)PI3K/Akt/eNOS信號通路對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響及可能機制，以期為卵巢癌分子靶向治療提供潛在證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌細胞株HO8910細胞（上海生物工程研究所提供）;RPMI-1640和DMEM（Gibco公司，美國）;RNA提取試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）;紫外線分光光度儀（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）;ABI PRISM7300系統(tǒng)（ABI，USA）;BCA試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）;Wes-tern blot蛋白檢測的兔多克隆一抗和山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司，Cambridge，MA，USA）;噻唑藍（MTT）溶液（Sigma公司，USA）;自動酶標(biāo)讀數(shù)儀（BIO-RAD公司，USA）;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Sigma公司，USA）;Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色試劑盒（BestBio公司，上海）;流式細胞儀（BD公司，USA）;Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，USA）;Transwell小室（康寧公司，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及其分組處理 人卵巢癌細胞株HO8910細胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。以每孔1×105個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿培養(yǎng)板80%～90%做傳代培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，傳代培養(yǎng)。

本實驗siRNA序列設(shè)計參照Genbank中報道的ErbB2的mRNA全序列，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對所有片段進行合成。選取對數(shù)生長期的HO8910細胞分為5組：空白對照組（A組：不轉(zhuǎn)染任何序列）、陰性對照組（B組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒）、siErbB2組（C組：轉(zhuǎn)染siRNA序列）、wortmannin組（D組：轉(zhuǎn)染PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制劑wortmannin）、siErbB2+IGF-1組（E組：轉(zhuǎn)染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信號通路激動劑IGF-1）。

1.2.2 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測 采用RNA提取試劑盒抽提總RNA。采用紫外線分光光度法檢測組織和細胞中RNA的純度及濃度。設(shè)計ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。逆轉(zhuǎn)錄參照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer說明書進行。取反應(yīng)液進行熒光定量PCR操作。在ABI PRISM7300系統(tǒng)中進行熒光定量PCR。以2-ΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關(guān)系。其計算公式如下：ΔCt=Ct miRNA-CtU6，分別計算細胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表達量。

1.2.3 Western blot檢測 在細胞中加入蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min;4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取上清液采用BCA試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度。本實驗所用一抗為兔多克隆抗體ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG。孵育后，室溫下PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。在暗室環(huán)境中用線片曝光，顯影、定影之后觀察結(jié)果。以GAPDH作內(nèi)參照，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達水平。

1.2.4 MTT法檢測 轉(zhuǎn)染24 h后，取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度制備細胞懸液后，接種到96孔培養(yǎng)板，根據(jù)實驗分組，每組各設(shè)3個復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩15 min，使紫結(jié)晶充分溶解。采用自動酶標(biāo)讀數(shù)儀于570 nm波長處測定各孔吸光度（A）值。最后根據(jù)所采集值，計算HO8910細胞的生長抑制率，繪制生長曲線。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞的密度。檢測前先離心10 min，棄上清后加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液固定細胞，4 ℃過夜。用100目的尼龍網(wǎng)過濾。離心棄上清，加入100 μL的RNA酶溶液。然后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL 的PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，用流式細胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 Transwell實驗 取Transwell小室及實驗所需試劑溫育后，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度。首先于24孔板底部加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)基平衡，取配制細胞懸液加入Transwell小室，孵育過夜。培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，吸干上室固定液，行甲紫染色。輕擦去上室內(nèi)面未穿膜的細胞，光鏡下計算細胞穿膜數(shù)。細胞侵襲實驗用Matrigel稀釋液模擬細胞外基質(zhì)，觀察細胞穿透向外浸潤的能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料采用x2±s的形式表示，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukeys方法。多組間A值隨時間的變化比較采用2因素析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組細胞相關(guān)信號通路因子mRNA和蛋白表達的變化

單因素方差分析顯示，5組間mRAN和蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.58～8.69，P均<0.05）。兩兩比較顯示，與空白對照組比較，siErbB2組和wortmannin組卵巢癌細胞中的Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量均顯著下降（P均<0.05），Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達量顯著增加（P均<0.05）;siErbB2組ErbB2的mRNA和蛋白表達量則顯著下降（P均<0.05）;與siErbB2組相比較，siErbB2+IGF-1組細胞Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量顯著上升，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達量則顯著下降（P均<0.05）。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細胞的增殖變化

MTT法檢測結(jié)果的單因素方差分析顯示，5組間的細胞增殖差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.84，P<0.05）。兩兩比較的結(jié)果顯示，與空白對照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細胞增殖較慢（P均<0.05）;與siErbB2組比較，siErbB2+IGF-1組細胞增殖增加（P<0.05）。析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)組別=7.31，P=0.002;F時間=10.49，P<0.001;F組別×?xí)r間=5.78，P<0.05。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細胞凋亡變化

單因素方差分析顯示，5組的凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.46，P<0.05）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細胞凋亡率均明顯上升（P均<0.05）;對比siErbB2組，siErbB2+IGF-1組凋亡率明顯下降（P<0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細胞遷移與侵襲的變化

轉(zhuǎn)染后各組細胞的遷移結(jié)果單因素方差分析顯示，5組的遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.57，P<0.05）。兩兩比較顯示，與陰性對照組相比較，siErbB2組和wortmannin組細胞遷移能力都顯著減弱（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1組遷移能力明顯上升（P<0.05）。轉(zhuǎn)染后各組細胞的侵襲結(jié)果單因素方差分析顯示，5組的侵襲能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.67，P<0.05）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比，siErbB2組和wortmannin組細胞侵襲能力明顯降低（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1組侵襲能力明顯上升（P<0.05）。見圖4。

3 討 論

卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)癌癥第三，但其病死率卻位居之首[9-12]。其發(fā)病隱匿，化療等綜合治療效果不顯著[13-17]。因此，提高卵巢癌早期診斷水平并探究其分子機制，對于提高卵巢癌病人生存率至關(guān)重要。而RNA干擾自其發(fā)現(xiàn)以來，便成為基因研究領(lǐng)域的熱點[18-21]?；虺聊夹g(shù)高效、方便，且具有極高特異性。ErbB2（HER2）基因在人類多種惡性腫瘤中呈高表達，且伴隨惡性程度更高的細胞表型，誘發(fā)癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[22-25]。既往研究者推測ErbB2在腫瘤細胞中的過度表達，與相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常相關(guān)，可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中良好的細胞生長環(huán)境[26]。也有學(xué)者報道，PI3K和Akt可以干擾細胞中ErbB2轉(zhuǎn)錄，進而影響該因子的致癌性[14]。因此，本研究作出如下假設(shè)：ErbB2基因沉默可能通過PI3K/Akt/eNOS信號通路發(fā)揮對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響。

本研究采用人卵巢癌細胞系HO8910細胞，進行分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，設(shè)置空白對照組和陰性對照組，以siErbB2組表示抑制ErbB2表達，以wortmannin組表示對PI3K/Akt/eNOS信號通路的抑制，并進一步構(gòu)建siErbB2+IGF-1組驗證假設(shè)推理。采用qRT-PCR和Western blot方法檢測各組細胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平。同時，應(yīng)用MTT法、流式細胞術(shù)、Transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測各組細胞增殖、凋亡、遷移能力和侵襲能力的變化。本文研究結(jié)果顯示，siErbB2組和siErbB2+IGF-1組ErbB2表達明顯下降，而wortmannin組無明顯變化，說明RNA干擾可作為研究ErbB2在卵巢癌中作用的有效工具。

為進一步了解ErbB2對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制。本研究后續(xù)實驗應(yīng)用ErbB2基因沉默技術(shù)和通路抑制劑wortmannin處理卵巢癌細胞，檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比較，siErbB2組和wortmannin組卵巢癌細胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量則顯著下降，Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達量顯著增加;而且與siErbB2組和wortmannin組相比，siErbB2+IGF-1組Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表達量顯著上升。我們推測采用wortmannin抑制劑后，PI3K/Akt/eNOS信號通路效應(yīng)分子PI3K、Akt、eNOS活化狀態(tài)被抑制，進而抑制腫瘤細胞生長并促進細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的低氧耐受和腫瘤微環(huán)境中的生存能力。

本文研究結(jié)果還表明，siErbB2組、wortmannin組和siErbB2+IGF-1組細胞增殖、侵襲和遷移能力均下降，而細胞凋亡率上升。與siErbB2組和wortmannin組相比較，siErbB2+IGF-1組細胞增殖、侵襲和遷移能力均上升，而細胞凋亡率下降。以上結(jié)果從PI3K/Akt/eNOS信號通路和細胞生物學(xué)特性兩個方面證實，ErbB2基因沉默或許可通過抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路，進而抑制細胞增殖并能促進細胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信號通路激活可發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用。提示ErbB2在卵巢癌的生長轉(zhuǎn)移的調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用，且其分子機制與PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關(guān)。

PI3K/Akt/eNOS信號通路在細胞增殖、凋亡中的作用，既往有眾多報道。例如，LI等[27]報道，F(xiàn)GF21抑制劑可通過eNOS/PI3K/Akt信號通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和遷移;AHSAN等[28]的結(jié)果顯示，磷酸肌酸可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS通路保護內(nèi)皮細胞免受氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的凋亡的影響。目前針對ErbB2基因沉默通過PI3K/Akt/eNOS信號通路發(fā)揮對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響的研究較少，本文借助RNA干擾技術(shù)，從基因和蛋白水平證實ErbB2基因沉默可有效影響人卵巢癌細胞株HO8910細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，提示ErbB2與卵巢癌細胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，且其可能機制與PI3K/Akt/eNOS信號通路的抑制有關(guān)。

綜上所述，本文的研究結(jié)果顯示，ErbB2在卵巢癌細胞中呈高表達，RNA干擾技術(shù)可有效抑制ErbB2表達;ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路，從而抑制卵巢癌細胞增殖、促進其凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信號通路激活可逆轉(zhuǎn)ErbB2基因沉默作用，促進卵巢癌細胞增殖并抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果為臨床卵巢癌的基因治療提供了潛在依據(jù)。值得注意的是，本研究以細胞實驗探究ErbB2在卵巢癌中的作用及其與PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)的分子機制，有待進一步動物實驗和臨床驗證。同時，抑制ErbB2在卵巢癌中的表達進而發(fā)揮抑癌作用是否受到其他信號通路的影響，均為本研究未來探討的方向。

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（本文編輯 于國藝）