李沖 陳蕾蕾 謝俊霞

[摘要]目的 研究鐵過載對原代神經(jīng)元發(fā)生衰老的影響。方法 取大鼠原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予100 μmol/L枸櫞酸鐵銨（FAC）處理24 h，對照組用不含F(xiàn)AC的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，通過檢測細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性評估細(xì)胞衰老狀況。結(jié)果 與對照組相比，在100 μmol/L FAC作用24 h時，實驗組原代神經(jīng)元衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加（t=18，P<0.05）。結(jié)論 鐵過載可誘導(dǎo)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)元;鐵;細(xì)胞衰老

[中圖分類號]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0174-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of iron overload on the senescence of primary neurons.?Methods Primary ventral midbrain neurons of rats were cultured in vitro and were randomly divided into control group and experimental group. The experimental group was treated with ferric ammonium citrate （FAC） （100 μmol/L） for 24 h， and the control group were treated with the medium without FAC. Cell senescence was evaluated based on the activity of β-galactosidase associated with cell senescence.?Results Compared with the control group， the experimental group had a significant increase in the activity of β-galactosidase associated with cell senescence after being treated by 100 μmol/L FAC for 24 h （t=18，P<0.05）.?Conclusion Iron overload can induce the senescence of primary neurons.

[KEY WORDS]neurons; iron; cell senescence

帕金森病是世界第二大神經(jīng)退行性疾病，典型病理特征是黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，α-突觸核蛋白的聚集和鐵沉積[1-3]。越來越多的證據(jù)表明鐵沉積會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，鐵過載是神經(jīng)元死亡的誘因而非結(jié)果[4-5]。除了可以通過氧化損傷途徑促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元死亡，大量的鐵可以促進(jìn)α-突觸核蛋白的表達(dá)[6]，也可從蛋白翻譯后水平影響其磷酸化[7-8]，促進(jìn)蛋白聚積，進(jìn)而損傷神經(jīng)元[9-10]。隨著年齡增加，多種器官發(fā)生鐵聚積，腦內(nèi)鐵沉積隨之不斷加劇[11]，過量鐵導(dǎo)致的氧化水平升高又會進(jìn)一步引發(fā)鐵蛋白釋放[12]。細(xì)胞衰老是細(xì)胞無法進(jìn)入細(xì)胞周期而處于停滯狀態(tài)，是防止細(xì)胞不受調(diào)控持續(xù)增殖的機制，主要表現(xiàn)為炎性因子的分泌、β-半乳糖苷酶活性增加以及衰老相關(guān)分泌表型 [13]。隨著年齡的增加，衰老細(xì)胞在體內(nèi)逐漸累積，衰老的細(xì)胞部分喪失生理活性，影響機體正常生理功能。在主要的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷頓癥病人腦內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了衰老的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[14-15]。

在疾病狀態(tài)下的神經(jīng)元也會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，據(jù)文獻(xiàn)報道，在γ射線誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老模型中，衰老細(xì)胞的鐵水平是正常細(xì)胞的30倍之多[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒素百草枯可誘發(fā)與帕金森病相關(guān)的細(xì)胞衰老和神經(jīng)病理特征[17]。

最近有研究表明，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的多巴胺能神經(jīng)元也觀察到衰老表型[18]。已有實驗證實，衰老細(xì)胞內(nèi)鐵含量明顯升高，衰老導(dǎo)致的鐵攝取和儲存異常會影響鐵介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程[11，16]，衰老的細(xì)胞若不及時清除，會進(jìn)一步損傷周圍細(xì)胞[19]。為了探討鐵過載能否引發(fā)神經(jīng)元衰老進(jìn)而引發(fā)死亡丟失，本研究用枸櫞酸鐵銨（FAC）對原代神經(jīng)元進(jìn)行處理，檢測其衰老發(fā)生情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

FAC（Sigma），胎牛血清（依科賽（澳洲源）），SA-β-Gal染色試劑盒（CST，9860S），DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco，1210038）以及DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone，SH30023.01），D-多聚賴氨酸、B27（Gibco），β-阿糖胞苷、青鏈霉素混合液、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（索萊寶）和倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX73）。

1.2 實驗方法

1.2.1 中腦腹側(cè)原代神經(jīng)元培養(yǎng) 將深度麻醉的孕12～14 d的Wistar大鼠用醫(yī)用乙醇噴灑消毒后，用手術(shù)剪沿大鼠的腹中線剪開至腹腔完全暴露，用鑷子取出串珠樣胚胎，放在預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中，迅速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上。用尖鑷將胎鼠剝離出來，先在解剖顯微鏡下將中腦組織塊取出轉(zhuǎn)移至新鮮的DMEM培養(yǎng)液中，再在鏡下修剪掉多余組織塊和血管膜，保留蝴蝶狀腹側(cè)，加入適量胰蛋白酶，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育消化，5 min后加入終止液終止消化。用1 mL移液槍輕柔地吹打盡量使組織塊分散，靜置片刻后吸取上清至50 mL離心管中，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液5 mL，重復(fù)上述步驟3次。將上清以1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入含有B27的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，接種到12孔板上，每孔1×105個細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后更換一半培養(yǎng)液，此后每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液，7 d后成熟的神經(jīng)元可用于后續(xù)實驗。經(jīng)β-阿糖胞苷處理，神經(jīng)元純度達(dá)90%以上，符合實驗要求。

1.2.2 實驗分組及處理 將細(xì)胞隨機分為對照組和實驗組。實驗組細(xì)胞加入100 μmol/L的FAC作用24 h，對照組細(xì)胞用不含F(xiàn)AC的低血清培養(yǎng)液進(jìn)行處理。

1.2.3 細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性檢測 應(yīng)用SA-β-Gal染色試劑盒檢測細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性。FAC處理24 h后，用0.01 mol/L PBS潤洗細(xì)胞2次，每次30 s，每孔細(xì)胞加入1 mL固定液，室溫固定15 min，用0.01 mol/L PBS沖洗細(xì)胞2次，每次30 s，棄掉洗液，每孔加入1.5 mL染色液，用封口膜密封細(xì)胞培養(yǎng)板防止染液蒸發(fā)，置37 ℃恒溫箱中孵育過夜。用0.01 mol/L PBS潤洗細(xì)胞2次，每次30 s，在奧林巴斯倒置顯微鏡明場下觀察并獲取圖像，陽性細(xì)胞顯示為亮藍(lán)色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果以x2±s表示，兩獨立樣本比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與對照組相比較，實驗組細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性染色明顯增強（圖1），對照組著色細(xì)胞比例為（2.077±0.440）%，實驗組著色細(xì)胞比例為（25.200±1.164）%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=18，P<0.05）。提示100 μmol/L FAC作用于原代神經(jīng)元24 h，細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加，表明100 μmol/L FAC可以誘導(dǎo)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老。

3 討 論

鐵是維持生命活動的關(guān)鍵微量金屬元素之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，參與腦內(nèi)線粒體呼吸、軸突髓鞘化以及神經(jīng)遞質(zhì)的形成[12]。鐵作為活潑金屬，也可以催化多種生化反應(yīng)，增加氧化應(yīng)激，過量的活性氧損傷細(xì)胞膜、核酸及蛋白結(jié)構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞毒性[20]。枸櫞酸是鐵的天然螯合劑，枸櫞酸鐵為枸櫞酸與鐵離子形成的鐵鹽，是美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的補鐵藥劑[21]。本實驗所用的FAC是枸櫞酸鐵更具溶解性的形式，添加FAC可模擬高鐵環(huán)境，以探討鐵過載對神經(jīng)元細(xì)胞衰老的影響。

對于體外培養(yǎng)細(xì)胞的衰老研究，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的活化是常用的生物學(xué)特征[22-23]。β-半乳糖苷酶是溶酶體水解酶，通常在pH值為4時表現(xiàn)出活性;而在衰老的細(xì)胞中，pH值為6時有活性，利用β-半乳糖苷酶底物進(jìn)行染色，就能從正常細(xì)胞中區(qū)分出衰老細(xì)胞[24]。本實驗采用100 μmol/L FAC處理原代神經(jīng)元24 h，觀察到β-半乳糖苷酶的陽性染色明顯增強，提示細(xì)胞衰老的發(fā)生。

越來越多的證據(jù)表明，鐵穩(wěn)態(tài)失衡促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[25-28]，鐵沉積是帕金森病一個主要的病理特征，也是人們普遍認(rèn)為的發(fā)病誘因。有研究證實，細(xì)胞內(nèi)鐵過載會增加氧化還原水平[29-30]，促進(jìn)α-突觸核蛋白的聚積，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，如二價鐵可以通過與α-突觸核蛋白mRNA的C端ASP-121、Asn-122、Glu-123位結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)α-突觸核蛋白表達(dá)，也可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白磷酸化等修飾過程，促進(jìn)蛋白聚集發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[31-32]，并且α-突觸核蛋白寡聚過程產(chǎn)生活性氧是鐵依賴性的[33]。鐵過載增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平可能是誘導(dǎo)衰老的重要機制。本實驗結(jié)果表明，鐵過載會誘發(fā)神經(jīng)元衰老，這為后續(xù)進(jìn)行神經(jīng)元變性死亡研究提供了新的思路。但處于衰老狀態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞是通過何種通路逐漸死亡丟失，神經(jīng)元衰老與目前已知凋亡、壞死和鐵死亡之間是否存在因果或先后關(guān)系，衰老在神經(jīng)元變性死亡過程中的具體機制還有待進(jìn)一步的研究探討。

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（本文編輯 馬偉平）