韓超逸，湯德元，廖少山，張森，楊志剛，晏仁潭

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬，對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅。JEV可通過(guò)蚊蟲為媒介傳播，引起人的病毒性腦炎死亡率達(dá)25%～30%，50%的存活者會(huì)留下永久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥；可致母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，公豬睪丸炎繁殖障礙，仔豬感染JEV死亡率可達(dá)100%[1]。目前，JEV并無(wú)特效治療藥物，疫苗接種是防控乙腦最有效的手段。

1 JEV基因組結(jié)構(gòu)

JEV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)11kb分為3個(gè)部分，分別是5′端和3′端的非編碼區(qū)(UTR)，以及中間的開(kāi)放閱讀框(ORF)。5′端UTR區(qū)長(zhǎng)95 nt含有帽子結(jié)構(gòu)，可保護(hù)5′端不被核酸酶或磷酸酶降解，促進(jìn)起始翻譯。3′端UTR區(qū)長(zhǎng)582 nt不具有poly A結(jié)構(gòu)，但含有一段對(duì)病毒復(fù)制極其重要的保守核苷酸序列。ORF區(qū)長(zhǎng)10.3 kb，幾乎貫穿整個(gè)基因組，編碼3 500個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體在宿主信號(hào)肽酶和JEV NS3蛋白的作用下切割為3種結(jié)構(gòu)蛋白：C、PrM、E，以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。

2 JEV非結(jié)構(gòu)蛋白功能

2.1 NS1蛋白

NS1蛋白由352個(gè)氨基酸組成，大小為46 kDa，是一種分泌型糖基化蛋白，在黃病毒科中高度保守。NS1蛋白具有3種形態(tài)分別位于細(xì)胞內(nèi)不同的位置，單體位于細(xì)胞內(nèi)，二聚體位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜，六聚體被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮其主要功能[2]。糖基化的NS1蛋白參與黃病毒粒子的組裝和釋放，六聚體形態(tài)的NS1蛋白與免疫逃避有關(guān)[3]。周玉鵬[4]通過(guò)將構(gòu)建的NS1誘餌質(zhì)粒與人腦組織cDNA文庫(kù)菌進(jìn)行雜交篩選互作蛋白，并通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)NS1蛋白與宿主蛋白DAZAP2互作，為進(jìn)一步揭示JEV感染過(guò)程中NS1蛋白與宿主蛋白互作機(jī)制提供了基礎(chǔ)。在黃病毒感染中NS1抗體或抗原是理想的生物診斷標(biāo)志。Zhou等[5]通過(guò)制備NS1多克隆抗體研發(fā)了檢測(cè)NS1抗體的阻斷ELISA，該方法有較高的靈敏度及特異性，為臨床JEV進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)以及疫苗接種后的免疫狀況評(píng)估提供了理想的方法。除此之外，NS1蛋白具有免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并且WNV NS1蛋白與JEV NS1蛋白有部分交叉保護(hù)作用[6-7]。紀(jì)美靜[8]使用原核表達(dá)純化的NS1蛋白間隔兩周對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)純化的NS1蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體，并且免疫效果要略好于E蛋白、M蛋白以及乙腦滅活疫苗及弱毒疫苗，該研究表明原核表達(dá)的NS1蛋白同樣具有良好的免疫原性，為原核表達(dá)大量制備NS1蛋白亞單位疫苗提供了理論支持。

2.2 NS1′蛋白

NS1′蛋白產(chǎn)生原因是由于NS2A基因易發(fā)生核糖體移碼，導(dǎo)致核糖體在NS1蛋白之后繼續(xù)翻譯，形成了NS1′蛋白[9]。疫苗毒株SA14-14-2 NS2A基因的A66G發(fā)生了突變，不會(huì)發(fā)生核糖體移碼，因此不會(huì)產(chǎn)生NS1′蛋白，故臨床可通過(guò)檢測(cè)NS1′蛋白來(lái)區(qū)分野毒感染和疫苗接種[10]。范煜[11]建立了檢測(cè)NS1′蛋白的雙抗體夾心ELISA法，該方法可特異性的檢測(cè)出重組的NS1′蛋白，以及強(qiáng)毒株感染細(xì)胞及攻毒小鼠血清中的NS1′蛋白，為臨床JEV野毒感染檢測(cè)提供了理想方法。NS1′蛋白可抑制細(xì)胞抗病毒反應(yīng)，Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)NS1′蛋白可通過(guò)上調(diào)miR-22抑制MAVS mRNA及蛋白的表達(dá)，減少Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，創(chuàng)造出有利于JEV復(fù)制的條件，該研究揭示了NS1′蛋白新的生物功能，為JEV抑制細(xì)胞天然抗病毒反應(yīng)機(jī)理增添了新的內(nèi)容。

2.3 NS2A蛋白

NS2A分子量約為17 kDa，為疏水跨膜蛋白參與JEV復(fù)制，NS2A 166位氨基酸對(duì)JEV的體外增殖和組織嗜性有重要作用，當(dāng)NS2A蛋白氨基酸發(fā)生H166Y突變時(shí)，JEV在Neuro-2a細(xì)胞中的生長(zhǎng)能力變強(qiáng)[13]。NS2A氨基酸位點(diǎn)發(fā)生K84A突變可抑制病毒復(fù)制，而R171A、K193A、R163A突變可直接導(dǎo)致JEV無(wú)法正常復(fù)制，對(duì)病毒產(chǎn)生致命影響。NS2A具有miR-499-5p的結(jié)合位點(diǎn)，miR-499-5p可靶向NS2A蛋白抑制JEV復(fù)制[14]。NS2A蛋白具有編碼病毒RNAi抑制因子(VSR)功能，可與dsRNA、siRNAs相互作用抑制RNAi天然免疫促進(jìn)病毒復(fù)制，其正氨基酸位點(diǎn)T33I、R98A、R140A與該功能緊密相關(guān)[15]。TRIM52蛋白是天然免疫抗病毒反應(yīng)中重要的參與者，可促進(jìn)RIG-Ⅰ的泛素化和激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN發(fā)生抗病毒作用[16]；NS2A可與TRIM25在細(xì)胞質(zhì)中共定位，NS2A可通過(guò)TRIM25 RING區(qū)與其互作，TRIM52可通過(guò)E3連接酶活性以蛋白酶體依賴性方式降解NS2A，抑制JEV感染[17]。

2.4 NS2B蛋白

NS2B為跨膜蛋白約由130個(gè)氨基酸組成，分子量為14 kDa。NS2B蛋白的中心親水區(qū)對(duì)于NS3蛋白酶激活具有重要作用，NS2B蛋白中心結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變可影響NS3蛋白酶活性，使病毒復(fù)制受限[18]。除此之外NS2B蛋白跨膜區(qū)域突變可減少JEV RNA合成和病毒的組裝[19]，表明NS2B蛋白跨膜區(qū)域?qū)EV組裝有著關(guān)鍵作用。Ma等[20]研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)酶肽復(fù)合物1(SPCS1)是JEV復(fù)制所必須的宿主因子，SPCS1可與NS2B的N端疏水跨膜結(jié)構(gòu)和C端疏水跨膜結(jié)構(gòu)互作參與病毒組裝，為JEV復(fù)制機(jī)制及JEV藥物潛在靶點(diǎn)的研究提供了參考。Fan等[21]研究發(fā)現(xiàn)NS2B蛋白氨基酸發(fā)生V99L替換可增強(qiáng)JEV復(fù)制能力，意味著NS2B蛋發(fā)生突變可能與JEV復(fù)制能力變化有關(guān)。

2.5 NS3蛋白

NS3蛋白分子量大小為72 kDa，具有絲氨酸蛋白酶活性以及RNA解旋酶，核苷酸三磷酸酶活性，可切割病毒蛋白參與JEV復(fù)制[22]。袁磊[23]通過(guò)構(gòu)建靶向NS3基因5361～5381位的shRNA質(zhì)粒，顯著降低了JEV mRNA含量93.9%，病毒滴度下降大約950倍，表明NS3基因5361～5381位具有成為JEV藥物研發(fā)靶點(diǎn)的巨大潛力。NS3蛋白可與熱休克蛋白DNAJB6及NS4B蛋白互作，并且二者過(guò)表達(dá)均會(huì)抑制JEV復(fù)制[24-25]。Jiang等[26]研究發(fā)現(xiàn)NS3蛋白解旋酶區(qū)域可與miRNA前體結(jié)合，導(dǎo)致前體miRNA錯(cuò)誤解鏈，抑制成熟miRNA生成。NS3蛋白可通過(guò)抑制宿主miR-466-3p表達(dá)從而促進(jìn)1L-1β表達(dá)以及JEV復(fù)制，而當(dāng)NS3蛋白R(shí)226和R202位精氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，對(duì)NS3蛋白對(duì)miR-466-3p抑制作用消失，該研究表明NS3蛋白不僅參與著JEV的復(fù)制，也在JEV所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著正向調(diào)控的作用。

2.6 NS4A蛋白

NS4A蛋白為跨膜蛋白，NS4A的N端是NS3的輔助因子，可調(diào)節(jié)NS3的核苷酸三磷酸酶活性參與JEV復(fù)制[27]。Yuan等[28]構(gòu)建了針對(duì)NS4A基因的shRNA質(zhì)粒，可降低細(xì)胞中JEV mRNA 82.0%，降低病毒滴度640倍，使用shRNA質(zhì)粒注射小鼠后JEV感染小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腦中的病毒載量降低800倍小鼠存活率為50%，表明NS4A是RNAi治療的潛在靶標(biāo)。

2.7 NS4B蛋白

NS4B蛋白為疏水蛋白具有膜修飾功能，NS4B蛋白具有5段疏水區(qū)域，其中3段為跨膜區(qū)域可協(xié)助于蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。NS4B膜外區(qū)域可與NS3解旋酶直接相互作用，過(guò)表達(dá)NS4B膜外區(qū)域可抑制JEV復(fù)制，降低病毒滴度約50%[25]，表明NS4B膜外區(qū)域可影響JEV復(fù)制。JEV感染細(xì)胞可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白可與PERK互作，NS4B中的LIG-FHA和LIG-WD40結(jié)構(gòu)域可誘導(dǎo)PERK發(fā)生二聚化激活PERK，Neuro-2a細(xì)胞過(guò)表達(dá)NS4B可激活PERK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，NS4B在JEV所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著正向調(diào)控的作用。

2.8 NS5蛋白

NS5蛋白是最大的黃病毒蛋白，具有病毒復(fù)制所需的甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴性RNA聚合酶活性，NS5蛋白R(shí)dRP結(jié)構(gòu)域可與Hsp70直接相互作用[30-31]。NS5蛋白參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的發(fā)生，Yang等[32]研究發(fā)現(xiàn)NS5蛋白可下調(diào)鈣網(wǎng)蛋白，鈣網(wǎng)蛋白下調(diào)可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，同時(shí)抑制STAT1、NFAT-1對(duì)IFN-β的核轉(zhuǎn)運(yùn)，拮抗細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。Ye等[33]研究發(fā)現(xiàn)NS5蛋白不影響IκBα和IRF3的磷酸化，但可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的與入核蛋白KPNA3和KPNA4相互作用，抑制IRF3和NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核減少Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，過(guò)表達(dá)KPNA3和KPNA4可恢復(fù)IRF3和NF-κB活性，恢復(fù)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，該研究揭示了JEV 利用NS5蛋白逃避宿主天然免疫反應(yīng)的新機(jī)制。Weng等[34]研究發(fā)現(xiàn)NS5蛋白可與Hsp70互作上調(diào)Hsp70表達(dá)，Hsp70上調(diào)可減少IFN-β誘導(dǎo)的ERK2、p38、MAPK和STAT1的磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡，表明NS5蛋白具有拮抗細(xì)胞凋亡的作用。

3 小結(jié)

JEV 7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白在其發(fā)揮生物學(xué)功能過(guò)程中扮演著不同的角色，目前研究表明，超過(guò)一半的非結(jié)構(gòu)蛋白都與JEV復(fù)制有關(guān)。其中NS3、NS4B、NS5還可通過(guò)調(diào)控JEV多誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡參與JEV致病過(guò)程；NS1′、NS2A、NS3、NS4B、NS5蛋白可拮抗細(xì)胞天然抗病毒反應(yīng)；NS1蛋白可成為JEV感染的診斷標(biāo)志，以及亞單位疫苗開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)蛋白，NS1′蛋白因?yàn)槠洚a(chǎn)生的特殊性更可成為區(qū)分疫苗毒和野毒株的關(guān)鍵蛋白。JEV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能見(jiàn)表1。

表1 JEV非結(jié)構(gòu)蛋白功能

由此可見(jiàn)，JEV非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制、致病，以及引起的天然免疫反應(yīng)，并且同一非結(jié)構(gòu)蛋白可具有以上多個(gè)功能，并且蛋白功能之間也存在著相互影響，JEV非結(jié)構(gòu)蛋白功能是復(fù)雜且重要的。因此，了解JEV非結(jié)構(gòu)蛋白功能，不僅有助于我們了解JEV的生物學(xué)特性，深入剖析其致病機(jī)制，更有助于我們了解變異JEV生物學(xué)功能，更能為JEV疫苗及藥物的研發(fā)提供參考。雖然，目前部分非結(jié)構(gòu)蛋白的功能和作用機(jī)制還不完善，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步JEV非結(jié)構(gòu)蛋白更多潛在的功能將會(huì)被發(fā)現(xiàn)。