靳文姣，翟彬，苑鵬濤，范升鑫，李遠(yuǎn)方，閆峰賓，孫桂榮，田亞?wèn)|，康相濤，李國(guó)喜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，河南 鄭州 450046)

家禽生產(chǎn)中，腹部脂肪組織的特征與雞的經(jīng)濟(jì)性狀高度相關(guān)[1]。腹腔內(nèi)脂肪過(guò)度沉積常常對(duì)肉質(zhì)性能產(chǎn)生負(fù)面影響，并增加飼料成本[2-4]。近年來(lái)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，地方雞種腹脂過(guò)度沉積現(xiàn)象也越來(lái)越嚴(yán)重[5]。地方雞種是我國(guó)家禽育種和優(yōu)質(zhì)雞生產(chǎn)的重要素材，因此，理解地方雞腹部脂肪組織發(fā)育的分子機(jī)制，將有益于資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用。固始雞是主要分布于河南省固始縣境內(nèi)的蛋肉兼用型地方品種，因其肉質(zhì)具有鮮嫩、可口和風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)良特征，而經(jīng)常被用作育種和生產(chǎn)的素材。但目前仍然缺乏對(duì)固始雞腹部脂肪組織發(fā)育分子機(jī)制的理解。

MicroRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度18～24 nt的內(nèi)源性小的非編碼RNA，可與特定mRNA的3′-UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[6]，廣泛參與機(jī)體發(fā)育、代謝以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[7-8]。脂肪組織發(fā)育涉及新脂肪細(xì)胞的增加(增生)和脂肪細(xì)胞中脂類蓄積的增加(肥大)等復(fù)雜的過(guò)程[9]，許多研究顯示miRNA也參與脂肪細(xì)胞增殖、分化和脂類代謝等脂肪組織發(fā)育相關(guān)的許多生物學(xué)過(guò)程調(diào)控。例如，bat-miR-33b[10]、miR-21[11]、miR-204[12]、 miR-378[13]、miR-125a-5p[14]、miR-200b[15]等miRNA已被證實(shí)可參與脂肪細(xì)胞增殖或分化調(diào)控。這說(shuō)明，miRNA可作為研究動(dòng)物脂肪組織發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制的新靶標(biāo)。但目前的一些研究還僅局限于少數(shù)農(nóng)業(yè)動(dòng)物。

有關(guān)雞腹脂發(fā)育相關(guān)miRNA的研究已有報(bào)道[16-20]。例如，Huang等[18]通過(guò)深度測(cè)序，從93日齡慢長(zhǎng)型中國(guó)地方雞北京油雞(低腹脂)和快長(zhǎng)型商業(yè)化肉雞品系科寶雞(高腹脂)的腹脂中鑒定到了230種已知miRNA和83種潛在的新miRNA。Yao等[19]和Wang等[20]分別從雞腹脂衍生前脂肪細(xì)胞中檢測(cè)到159種已知miRNA和33種差異miRNA。這些研究表明，雞腹脂發(fā)育受許多miRNA的調(diào)控。但先前的研究還主要集中于少數(shù)品種和腹脂發(fā)育特定階段miRNA鑒定，而對(duì)特定miRNA在雞腹脂發(fā)育中的作用機(jī)制研究還很少。

前期，我們完成了6、14、22、30周齡固始雞腹脂miRNA的高通量測(cè)序，篩選鑒定到507種已知miRNA和53種新的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-215-5p在固始雞腹脂4個(gè)發(fā)育階段間高豐度差異性表達(dá)[21]。NCOA3基因可與核激素受體互作，與脂類代謝和沉積密切相關(guān)[22]。Wang等[23]研究顯示，NCOA3基因的表達(dá)量隨著肌內(nèi)脂肪含量的增加而升高，表明NCOA3基因?qū)χ境练e可能存在正向調(diào)控作用。靶基因預(yù)測(cè)表明，在NCOA3基因3′-UTR上，存在miR-215-5p的結(jié)合位點(diǎn)。這表明，miR-215-5p可能通過(guò)靶向作用于NCOA3而調(diào)控固始雞腹脂發(fā)育?；诖耍疚难芯苛薽iR-215-5p對(duì)固始雞腹部前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響及其與NCOA3基因的靶向關(guān)系，所得結(jié)果為更好地理解固始雞腹部脂肪組織發(fā)育的分子機(jī)制提供新的見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

選擇14周齡健康固始雞6只，解剖后，取心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腿肌、皮脂、腎臟、腹脂等組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱待用，用于miR-215-5p組織表達(dá)譜分析。另外，選擇14日齡固始雞雛雞，解剖分離腹部脂肪組織，用于原代前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)。

1.2 原代前脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

取14日齡固始雞雛雞，無(wú)菌條件下處死后于75%酒精中浸泡10 min，解剖分離腹部脂肪組織，用含0.8%鏈霉素/青霉素的PBS連續(xù)沖洗3次后剪碎。將剪碎后的組織塊置于含1 mg/mL膠原蛋白酶Ⅱ(9001-12-1，索萊寶)的DMEM(SH30023.01，HyClone)中，37 ℃消化1 h。消化完全后加入紅細(xì)胞裂解液，室溫下裂解10 min，隨后分別通過(guò)100目、200目和500目的篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心濾液5 min。用完全培養(yǎng)基(DMEM+10% 胎牛血清(04-001-1ACS，BI)+1%雙抗(P1400，索萊寶)重懸細(xì)胞后，鋪于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，于6孔板中進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，用含160 mol/L油酸的完全培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，分別在誘導(dǎo)后0、2、4、6、8 d收集細(xì)胞樣品。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

采用lipofactamine 2000試劑(11668019，invitrogen)，按照試劑盒操作說(shuō)明，將濃度為50 nmol/L 的miR-215-5p mimics(5′-AUGACCUAUGAAUUGACAGCA-3′，5′-CUGUCAAUUCAUAGGUCAUUU-3′)和mimics NC(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)以及濃度為100 nmol/L的miR-215-5p 抑制劑(5′-GUCUGUCAAUUCAUAGGUCAU-3′)和抑制劑對(duì)照 (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)(銳博生物)分別轉(zhuǎn)染到前體脂肪細(xì)胞中。試驗(yàn)在12孔板或96孔板中進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到60% ～ 70%(增殖試驗(yàn))或70% ～ 80%(分化試驗(yàn))時(shí)，完成轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞樣品。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RCR(qRT-PCR)分析

分別采用Primer SeriptTMRT reagent Kit和Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis試劑盒(R323，R312，諾維贊)對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得mRNA、miRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA。定量PCR分析，在Roche LightCycler?96儀器上進(jìn)行；mRNA所用引物序列見(jiàn)表1，由尚亞生物技術(shù)有限公司合成；miR-215-5p和U6的反轉(zhuǎn)錄和定量引物購(gòu)自銳博生物有限公司，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 12 s，60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。分別以U6、β-actin作為miRNA和mRNA定量的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA或mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR分析所用引物

1.5 CCK-8和EdU分析

通過(guò)CCK-8 (MA0218，美侖生物) 和EdU(C10310-1，銳博生物)分析，評(píng)價(jià)miR-215-5p對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖的影響。當(dāng)接種細(xì)胞生長(zhǎng)至60% ～ 70%融合時(shí)，將miR-215-5p mimics和mimics NC以及miR-215-5p inhibitors和inhibitors NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)于CCK-8分析，按照試劑盒操作說(shuō)明在96孔板上進(jìn)行，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、36、48 h，向每孔細(xì)胞各加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)450 nm處)檢測(cè)細(xì)胞活力。對(duì)于EdU分析，在6孔板上進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后 36 h，用25 μmol/L濃度的EdU溶液孵育細(xì)胞4 h，染色后使用熒光倒置顯微鏡拍照。上述試驗(yàn)各處理均設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.6 油紅O染色和甘油三酯含量分析

將前體脂肪細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)，待細(xì)胞70%～80%融合，轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics和mimics NC以及miR-215-5p inhibitors和inhibitors NC，并于轉(zhuǎn)染24 h后更換含160 mol/L油酸(112-80-1，索萊寶)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化后24 h，進(jìn)行油紅O染色和甘油三酯含量分析，以評(píng)價(jià)脂肪細(xì)胞充脂情況。對(duì)于油紅O染色，用4%多聚甲醛溶液固定處理細(xì)胞30 min后，加油紅O染液，室溫孵育20 min，棄掉染液用PBS清洗細(xì)胞3次，熒光倒置顯微鏡下拍照。然后，向每孔染色后的細(xì)胞中加入500 μL異丙醇，10 min后用酶標(biāo)儀在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。另外，采用組織細(xì)胞甘油三酯(TG)酶法試劑盒 (E1013-105，普利萊) 檢測(cè)脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量，細(xì)胞裂解后，按照試劑盒操作對(duì)裂解后的細(xì)胞進(jìn)行處理，用酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白含量(595 nm處)和甘油三酯含量(550 nm處)。上述試驗(yàn)各處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7 載體構(gòu)建和雙熒光素酶活性分析

使用正向引物5′-CCGCTCGAGGTGCTGTACAAAAAAGGTCATATTTTTGGC-3′ 和反向引物5′-ATAAGAATGCGGCCGCGGTATTTCAGGGCTGGCTCTAC-3′擴(kuò)增包含miR-215-5p結(jié)合位點(diǎn)的NCOA3-3′-UTR序列(NCOA3-3′-UTR-WT)；使用突變引物(F:5′-CCGCTCGAGGTGCTGTACAAAAAGTTCAGTATTTTTGGC-3′, R:5′-ATAAGAATGCGGCCGCGGTATTT-CAGGGCTGGCTCTAC-3′)擴(kuò)增包含突變miR-215-5p結(jié)合位點(diǎn)的NCOA3-3′-UTR序列(NCOA3-3′-UTR-Mut), 片段長(zhǎng)度均為130 bp。2個(gè)片段擴(kuò)增成功后，進(jìn)行膠回收，用XhoⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并分別與T載體連接；隨后再利用XhoⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶，對(duì)NCOA3-3′-UTR-WT、NCOA3-3′-UTR-Mut和 psiCHECK2空載體進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物連接psiCHECK2載體。最后，對(duì)成功連接psiCHECK2載體的菌液進(jìn)行大量搖菌，提取重組質(zhì)粒，分別命名為WT-NCOA3和MUT-NCOA3。

熒光素酶活性分析，在雞成纖維細(xì)胞系(DF1細(xì)胞)上完成，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在24孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，利用lipofactamine 2000試劑，將miR-215-5p mimics與WT-NCOA3或MUT-NCOA3分別共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，按照Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒 (Promega) 操作說(shuō)明，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解并檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P值的計(jì)算采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 雞miR-215-5p的表達(dá)譜特征

采用qRT-PCR分析了miR-215-5p在固始雞14周齡8種組織中以及腹部前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-215-5p在腹脂中相對(duì)表達(dá)量最高，其次為腎臟和皮脂(圖1A)，這表明miR-215-5p可能與雞腹部脂肪沉積相關(guān)。另外，在前脂肪細(xì)胞分化的前兩天，miR-215-5p表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，至第2天達(dá)第一個(gè)峰值；從前脂肪細(xì)胞分化后第4天，miR-215-5p的表達(dá)又逐漸上升，到分化后第8天達(dá)到峰值(圖1B)。前體脂肪細(xì)胞分化前期伴隨著細(xì)胞增殖，因此miR-215-5p的這種動(dòng)態(tài)表達(dá)結(jié)果表明，其在雞前體脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中可能均發(fā)揮作用。

A. 在不同組織中的表達(dá)；B. 在腹部前脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)

2.2 miR-215-5p抑制雞腹部前體脂肪細(xì)胞增殖

分別將miR-215-5p mimics和mimics NC以及miR-215-5p inhibitors和inhibitors NC轉(zhuǎn)染固始雞腹部前體脂肪細(xì)胞，以評(píng)價(jià)miR-215-5p對(duì)雞前脂肪細(xì)胞增殖的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics后，前脂肪細(xì)胞中miR-215-5p表達(dá)水平提高了350倍(圖2A)；相反，轉(zhuǎn)染miR-215-5p inhibitors后，前脂肪細(xì)胞中miR-215-5p的表達(dá)水平下降了50倍(圖2B)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics的前脂肪細(xì)胞中，細(xì)胞增殖標(biāo)志基因(CDK1和PCNA)的表達(dá)水平比對(duì)照組極顯著下降(P<0.01)，而細(xì)胞周期阻滯因子(p21)的表達(dá)水平比對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)(圖2C)。相反，在轉(zhuǎn)染miR-215-5p inhibitors的前脂肪細(xì)胞中，與對(duì)照組相比CDK1和PCNA的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，p21的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖2D)。EdU分析表明，過(guò)表達(dá)miR-215-5p可顯著降低EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例(圖3A，3B)，而抑制miR-215-5p可顯著提高EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例(圖4A，4B)。CCK-8檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics可顯著降低前脂肪細(xì)胞總數(shù)(圖3C)，而轉(zhuǎn)染miR-215-5p inhibitors可顯著增加前脂肪細(xì)胞總數(shù)(圖4C)。這些結(jié)果證明，miR-215-5p可抑制雞腹部前脂肪細(xì)胞的增殖。

A和B分別為miR-215-5p mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染后前脂肪細(xì)胞中miR-215-5p的表達(dá)量；C和D分別是miR-215-5p mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染后前脂肪細(xì)胞中增殖標(biāo)志基因的表達(dá)量。*P<0.05，**P<0.01。下同

A．EdU檢測(cè)分析；B. EdU陽(yáng)性細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)；C. CCK-8分析

A. EdU檢測(cè)分析；B. EdU陽(yáng)性細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)；C. CCK-8分析

2.3 miR-215-5p抑制雞腹部前體脂肪細(xì)胞分化

將miR-215-5p mimics和mimics NC以及miR-215-5p inhibitors和inhibitors NC分別轉(zhuǎn)染固始雞腹部前脂肪細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以評(píng)價(jià)miR-215-5p對(duì)雞前脂肪細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics可顯著抑制脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARG、CEBPA、FABP4和LPL的表達(dá)(圖5A)，而miR-215-5p inhibitors處理則得到了相反的結(jié)果(圖5B)。相應(yīng)地，過(guò)表達(dá)miR-215-5p顯著減少了分化脂肪細(xì)胞中脂滴的數(shù)量，降低了脂質(zhì)積累(圖6)；抑制miR-215-5p表達(dá)則顯著增加了分化脂肪細(xì)胞中脂滴的數(shù)量，促進(jìn)了脂質(zhì)積累(圖7)。同樣，轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics的脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量極顯著降低(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-215-5p inhibitors的脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量則顯著升高 (P<0.05)(圖8)。這些結(jié)果表明，miR-215-5p可抑制雞腹部前體脂肪細(xì)胞的分化。

圖5 過(guò)表達(dá)(A)/抑制(B)miR-215-5p對(duì)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因相對(duì)表達(dá)量的影響

A.油紅O染色；B.油紅O含量分析(500 nm波長(zhǎng)處讀取的OD值)

A.油紅O染色；B.油紅O含量分析(500 nm波長(zhǎng)處讀取的OD值)

圖8 過(guò)表達(dá)/抑制miR-215-5p后脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯

2.4 miR-215-5p可直接靶作用于NCOA3基因

為揭示miR-215-5p在雞腹部前脂肪細(xì)胞增殖和分化中的作用機(jī)制，利用TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，雞NCOA3基因3′-UTR存在miR-215-5p種子區(qū)序列的結(jié)合位點(diǎn)(圖9A)。在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-215-5p時(shí)，可顯著抑制NCOA3基因的表達(dá)(P<0.01)；相反，抑制miR-215-5p表達(dá)時(shí)可顯著促進(jìn) NCOA3基因的表達(dá)(P<0.05)(圖9B)。這表明，在雞腹部前體脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，miR-215-5p和NCOA3基因可能存在潛在的靶向互作關(guān)系?；诖?，在DF1細(xì)胞上，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)，驗(yàn)證了miR-215-5p和NCOA3的直接靶向關(guān)系。結(jié)果顯示，將miR-215-5p mimics和野生型或突變型psiCHECK2-NCOA3-3′UTR載體共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞48 h后，miR-215-5p可顯著抑制野生型載體熒光素酶活性(P<0.01)，而miR-215-5p與突變型載體共轉(zhuǎn)染則可解除該抑制效果(圖9C)。結(jié)果表明，miR-215-5p可直接靶作用于NCOA3基因。

A．miR-215-5p在NCOA3基因mRNA 3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)序列；B.過(guò)表達(dá)/干擾miR-215-5p后脂肪細(xì)胞中NCOA3的相對(duì)表達(dá)量；C.雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

3 討論

miR-215屬于mir-192基因家族成員，其在物種間高度保守，對(duì)維持物種進(jìn)化具有重要作用[24]。在人類中，miR-215為基因內(nèi)miRNA，與其宿主基因一起轉(zhuǎn)錄；而miR-215宿主基因異亮氨酰tRNA合成酶2(isoleucyl-tRNA synthetase 2，IARS2)為丙氨酰tRNA合成酶的一種，在蛋白質(zhì)合成第一步催化氨基酸與同源tRNA的共價(jià)結(jié)合。研究顯示，miR-215和IARS2的表達(dá)在Hirschsprung疾病患者中呈正相關(guān)[25]。另外，miR-215位于常見(jiàn)的脆弱位點(diǎn)(common fragile site)FRA1H(1q41-q42.1)內(nèi)，而該位點(diǎn)在許多類型的癌癥中缺失[26]。因此，miR-215是人類疾病中被廣泛研究的一個(gè)miRNA，尤其是在不同類型的癌癥中作為致癌基因而受到重視[24]。與此相比，有關(guān)雞miR-215的研究報(bào)道還很少。Cai等[27]證實(shí)，miR-215-5p在雞心臟中可靶作用于CTCF，而硒缺乏可通過(guò)直接靶向作用于miR-215-5p/CTCF軸影響心肌發(fā)育和分化；同時(shí)，也證明miR-215-5p可通過(guò)直接結(jié)合PI3K基因3′UTR，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/TOR通路和 ROS-dependent MAPK通路而調(diào)控心肌細(xì)胞存活，在調(diào)控反饋環(huán)中發(fā)揮自噬調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)雞心肌自噬[28]。這表明，miR-215在雞組織器官發(fā)育調(diào)控中也發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們通過(guò)qRT-PCR分析了雞miR-215-5p的表達(dá)譜特征，發(fā)現(xiàn)miR-215-5p在雞腎臟組織高表達(dá)，這與先前報(bào)道的 miR-215在人腎臟正常組織中高度富集的結(jié)果相一致[29]。尤其重要的是，在所檢測(cè)的8種組織中，miR-215-5p在雞腹部脂肪組織中表達(dá)水平最高，進(jìn)一步的分析顯示miR-215-5p在雞腹部前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程呈現(xiàn)明顯的時(shí)序表達(dá)特征。這表明，miR-215-5p與雞腹脂發(fā)育或脂肪沉積密切相關(guān)。

脂肪組織發(fā)育是新脂肪細(xì)胞增生和脂肪細(xì)胞肥大的結(jié)果[9]，而腹部脂肪塊的大小則由該部位脂肪細(xì)胞的數(shù)量和體積決定的。因此，揭示脂肪細(xì)胞增殖和分化機(jī)理是闡釋雞腹部脂肪組織發(fā)育及相關(guān)性狀形成分子機(jī)制的關(guān)鍵。雖然許多miRNA已被證明可參與動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖和分化調(diào)控[10-15]，但有關(guān)雞腹脂發(fā)育過(guò)程特定miRNA功能研究還很少。先前的許多研究已證實(shí)，miR-215在細(xì)胞和組織發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和增殖、細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞微環(huán)境和代謝等基本細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[24]。為此，本研究通過(guò)miR-215-5p mimics和mimics NC、miR-215-5p inhibitors和 inhibitors NC轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，闡明了miR-215-5p對(duì)腹部前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響，以解釋miR-215-5p在雞腹部脂肪組織發(fā)育的作用。在前脂肪細(xì)胞增殖方面，我們發(fā)現(xiàn)，miR-215-5p mimics處理可提高p21的表達(dá)水平，而顯著降低CDK1和PCNA的表達(dá)；相反，miR-215-5p innibitors處理顯著降低了p21的表達(dá)水平，而顯著提高了CDK1和PCNA的表達(dá)水平。已知CDK是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[30]，PCNA是DNA聚合酶的一種輔助性因子[31]，二者對(duì)細(xì)胞增殖起著正向調(diào)控的作用；而p21可抑制 CDK家族各成員的活動(dòng)[32]，從而阻滯細(xì)胞增殖。因此，上述結(jié)果表明，miR-215-5p可抑制雞前體脂肪細(xì)胞增殖，尤其是EdU和CCK-8的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。已知PPARG、CEBPA和LPL是前脂肪細(xì)胞分化早期標(biāo)志基因[33-34]，而FABP4(aP2)則是脂肪細(xì)胞分化后期標(biāo)志基因[35]。當(dāng)固始雞腹部前脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-215-5p時(shí)，可顯著抑制這些脂肪分化標(biāo)志基因的表達(dá)，同時(shí)脂滴蓄積明顯減少；而抑制miR-215-5p則獲得了相反結(jié)果。這些結(jié)果表明，miR-215-5p可抑制雞腹部前體脂肪細(xì)胞分化，這與先前在3T3-L1細(xì)胞上的研究結(jié)果相一致[36]?？傊?，miR-215-5p是雞腹部前脂肪細(xì)胞增殖和分化的負(fù)調(diào)控因子，其通過(guò)抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化而影響雞腹部脂肪組織的發(fā)育。

miRNA通過(guò)與其靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。因此，靶基因鑒定是揭示miRNA作用機(jī)制的關(guān)鍵。許多研究證明，一些miRNA可直接靶作用于脂肪形成相關(guān)基因而影響脂類代謝或沉積，如miR-155可直接靶作用于脂肪形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ[37]，miR-200b-3p在3T3-L1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可降低PPARγ的表達(dá)水平[38]。已知NCOA3基因可參與脂類和脂蛋白代謝(metabolism of lipids and lipoproteins)、脂類代謝的PPARα調(diào)控(regulation of lipid metabolism by pero-xisome proliferator activated receptor alpha)、白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(transcriptional regulation of white adipocyte differentiation)等與脂類代謝相關(guān)的通路調(diào)控。先前的一些研究也證實(shí)，NCOA3在調(diào)節(jié)小鼠脂肪蓄積中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39-40]；并且，敲除NCOA3基因后，小鼠模型的脂肪沉積顯著減少[41-42]；此外，NCOA3能與PPARγ相結(jié)合，減少PPARγ-S114磷酸化，促進(jìn)PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)脂肪沉積[43]。在豬前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，NCOA3可被miR-17-5p靶向作用[22]。這些研究表明，NCOA3是脂類代謝或沉積的一個(gè)重要的正向調(diào)控因子。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)試驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)也證明，在雞腹部前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，NCOA3是miR-215-5p的一個(gè)直接靶基因。因此，miR-215-5p可通過(guò)靶作用于NCOA3而負(fù)調(diào)控雞腹部脂肪形成。

生物體內(nèi)，一個(gè)miRNA能夠調(diào)控許多靶基因。在不同生物學(xué)背景中，miR-215的許多靶基因已經(jīng)被確定。例如，在3T3-L1細(xì)胞中，miR-215-5p通過(guò)靶作用于III型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域3B(fibronectin type Ⅲ domain containing 3B，F(xiàn)NDC3B)和連環(huán)蛋白beta互作蛋白1(catenin, beta interactingprotein 1，CTNNBIP1)而負(fù)調(diào)控3T3-L1細(xì)胞早期脂肪形成[36]。在胃癌中，miR-215可直接靶作用于轉(zhuǎn)錄因子RUNX1(runt-related transcription factor 1)[44]，而RUNX1在所有造血部位表達(dá)，有助于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的形成[45]。然而，miR-215-5p在雞這些基因上都沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)。事實(shí)上，miRNA與基因mRNA的靶向互作關(guān)系因組織、細(xì)胞類型和生理狀態(tài)而不同[46]。因此，我們推測(cè)，在雞腹部前脂肪細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中，miR-215-5p可能還存在許多未知的靶基因，它們形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與雞腹脂沉積調(diào)控，下一步將聚焦于雞腹脂形成相關(guān)靶基因的鑒定和互作調(diào)控機(jī)制研究。