陳紹華 ，王沁筠 ，吳昌桂 ，趙嘯 ，徐浩 ，施杞 ，梁倩倩 *

本研究背景：

急性痛風性關節(jié)炎（AGA）并非單一因素致病，多數(shù)AGA患者采用常規(guī)對癥治療效果不理想且不良反應較多。中藥復方以多成分、多靶點作用而在降尿酸、緩解AGA癥狀等方面具有獨特療效，但具體作用機制尚不完全明確。

本研究創(chuàng)新性：

本研究首次應用C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關節(jié)周圍注射尿酸單鈉（MSU）誘導的AGA動物模型而探究當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，初步證實當歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調節(jié)炎性因子的表達、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個核心問題的有效方劑且安全性較高。

本研究局限性：

本研究為小鼠實驗，由于目前尚無穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，因此尚不能預估當歸拈痛湯對血尿酸的長期控制效果，臨床推廣尚需進行倫理學審核及大樣本量隨機對照試驗進一步驗證。

發(fā)生于第一跖趾關節(jié)的急性痛風性關節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛風的首要臨床表現(xiàn)，男性多發(fā)［1-2］，通常表現(xiàn)為劇烈疼痛伴紅腫［3］，呈急性發(fā)作性，并會逐步進展為慢性［4-5］。據統(tǒng)計，當前全球痛風患病率為0.1%～10.0%［6］；我國男性痛風患病率為1.20%～2.60%，女性痛風患病率為0.01%～0.72%［7-11］，近年來我國痛風患病率呈逐年升高趨勢。

AGA的發(fā)生發(fā)展主要涉及以下幾個環(huán)節(jié)：（1）機體尿酸排泄不足引發(fā)高尿酸血癥［12-13］，同時體內濃度較高的尿酸導致尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）在關節(jié)及關節(jié)周圍沉積；（2）沉積的MSU晶體與駐留的巨噬細胞相互作用而導致NLRP3炎性小體形成、激活；（3）活化的NLRP3炎性小體通過募集胱天蛋白酶1而將促白介素1β加工為成熟的白介素1β（IL-1β）［14］，進而通過活化中性粒細胞和肥大細胞放大炎性反應，最終導致一系列炎性因子、趨化因子釋放［15］。

對于AGA，若處理不當則可能導致不可逆性組織破壞、骨侵蝕，最終造成關節(jié)疼痛、僵硬［2］。目前，臨床治療AGA要求盡快開始消炎止痛、終止急性發(fā)作［16］，推薦的治療方案是應用非甾體抗炎藥、秋水仙堿及糖皮質激素［17］，但上述藥物治療作用單一、長期服用不良反應較大，同時AGA的發(fā)生是多種因素作用的結果而非由單一因素所致［1-2］，因此消炎止痛并非AGA的最佳治療方案。對于AGA的治療，不僅要終止急性炎癥發(fā)作，還要對尿酸進行有效管理并清除沉積的MSU結晶。中藥復方當歸拈痛湯是臨床治療濕熱蘊結型AGA的常用方劑，但其具體作用機制尚不清楚。本研究為小鼠實驗，旨在探討當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，以期為后續(xù)研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2020-08-17至2020-10-07實施。2020年8月，筆者所在課題組從上海杰思捷實驗動物有限公司購入30只10～12周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量為20～27 g，平均體質量為（24±3）g；實驗動物許可證號為SCXK（滬）2018-0004；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物房并保證充足的食物和潔凈的水。本研究通過上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.2 藥物、試劑、儀器

1.2.1 藥物 當歸拈痛湯由羌活15 g、茵陳15 g、豬苓9 g、澤瀉9 g、黃芩3 g、苦參6 g、防風9 g、升麻3 g、葛根6 g、白術3 g、蒼術6 g、黨參6 g、當歸9 g、知母9 g、（炙）甘草15 g組成，均購自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房。0.9%氯化鈉溶液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，國藥準字：H34023609，批號：20010808S，規(guī)格：500 ml）購自上海市長寧區(qū)天山中醫(yī)醫(yī)院藥房。

1.2.2 試劑 MSU晶體（Sigma，貨號：U2875-25G）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（Servicebio，貨號：G0002-2L）；尿酸檢測試劑盒（微板法）（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：C012-2-1）；異氟烷（沃瑞德，貨號：Batch NO.217140901，規(guī)格：100 ml）；8分鐘RNA快速提取試劑盒（EZBioscience，貨號：B0004DP），帶gDNA Remover的彩色反轉錄試劑盒（EZBioscience，貨號：A0010CGQ），ROX2 plus彩色實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒（EZBioscience，貨號：A0012-R2）。特定基因引物購自華大基因，其中β-actin基因正向引物序列為5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，反向引物序列為5'-TAGGAGCCAGAGCAGTAATC-3'；IL-1β基因正向引物序列為5'-CTGGTACATCAGCACCTCAC-3'，反向引物序列為5'-AGAAACAGTCCAGCCCATAC-3'；腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因正向引物序列為5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3'， 反 向 引 物序 列 為5'-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTAT-3'； 誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因正向引物序列為5'-AACGGAGAACGTTGGATTTG-3'，反向引物序列為5'-CAGCACAAGGGGTTTTCTTC-3'。

1.2.3 儀器 Bio Tek Cytation3細胞成像多功能檢測系統(tǒng)，Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀，Denovix DS-11超微量紫外可見分光光度計，Thermal cycler block 5020PCR熱循環(huán)儀，Matrx小動物專用吸入麻醉機，JY88-IIN-超聲波細胞粉碎機；Shangping FA1004N電子天平，美耐特高精度電子數(shù)字顯示游標卡尺，Hamilton 80600微升注射器（100 μl），1 ml無菌注射器（精度10 μl）和灌胃針，Eppendorf微量移液器，Costar96孔酶標板及Bio-Rad 96孔qPCR板等。

1.3 方法

1.3.1 藥劑制備方法 按照常規(guī)體質量對小鼠（25 g）與人（60 kg）中藥劑量進行換算（換算系數(shù)為9.01），則小鼠需服中藥煎劑濃度為2.56 g/ml。取上述中藥1劑，加12倍水浸泡30 min后煮沸，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，趁熱過濾獲得煎液1；所余藥渣加8倍水，采用同樣的煮沸方法而獲得煎液2；合并兩次煎液并置于通風櫥中加熱、濃縮至48 ml即為當歸拈痛湯中藥液，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 動物分組及AGA小鼠模型建立方法 適應性飼養(yǎng)1周后將30只小鼠編號并采用隨機數(shù)字表法分為對照組、溶劑組和DGNTT組，每組10只。稱取MSU晶體30 mg，溶于1.0 ml PBS并置于1.5 ml 微型離心管（EP管）中，充分震蕩后使用JY88-IIN-超聲波細胞粉碎機（強度25%、運行5 s停10 s）粉碎1 min，使其變?yōu)榫鶆虻娜榘咨玀SU懸液（濃度為3%）。使用Hamilton 80600微升注射器在溶劑組和DGNTT組小鼠在雙側足掌深層跖跗關節(jié)周圍注射MSU懸液，20 μl/次，隔日1次，共注射3次誘導造模；對照組小鼠在雙側足掌深層跖跗關節(jié)周圍注射PBS，20 μl/次，隔日1次，共注射3次。

1.3.3 治療方法 三組小鼠于造模完成后同時開始給藥，其中對照組和溶劑組小鼠予以0.9%氯化鈉溶液灌胃，DGNTT組小鼠予以當歸拈痛湯中藥液灌胃，均為0.2 ml/次，1次/d；三組小鼠均連續(xù)灌胃1周。

1.4 觀察指標 （1）體質量：分別于治療前后測量三組小鼠體質量；（2）足掌厚度增長百分比：注射MSU懸液后6 h通常為AGA小鼠炎性腫脹達到峰值的時間點［18］，因此分別于造模前、造模后6 h、治療后1～7 d固定時間點（每日上午10點）采用美耐特高精度電子數(shù)字顯示游標卡尺測量小鼠足掌厚度以計算足掌厚度增長百分比，注意選取小鼠足爪腫脹最甚處；（3）IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量：治療后7 d取三組小鼠注射足部組織，去皮后采用磁珠研磨，先采用8分鐘RNA快速提取試劑盒提取mRNA，再采用ROX2 plus彩色qPCR試劑盒檢測IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量，重復3次取平均值，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作；（4）血尿酸濃度：治療后7 d摘取三組小鼠眼球并采血約1 ml，靜置2 h后采用高速冷凍離心機離心（3 000 r/min、4 ℃）15 min，吸取上層淡黃色血清300～400 μl至新的EP管中并做好標記，放置于-80 ℃冰箱保存，采用尿酸檢測試劑盒（微板法）、酶比色法檢測血尿酸濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內治療前后比較采用配對t檢驗；重復測量數(shù)據采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。圖的制作采用Graphpad Prism 8.0軟件。

2 結果

2.1 體質量 三組小鼠治療前體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.988，P=0.386），具有可比性；三組小鼠治療后體質量比較，差異亦無統(tǒng)計學意義（F=0.534，P=0.592）。三組小鼠治療后體質量與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t配對值分別為1.84、1.163、0.714，P值分別為0.10、0.275、0.495），見圖1。

圖1 三組小鼠治療前后體質量比較Figure 1 Comparison of body weight in the three groups of mice before and after treatment

2.2 足掌厚度增長百分比 時間與方法在足掌厚度增長百分比上存在交互作用（F交互=49.83，P交互＜0.001）；時間、方法在足掌厚度增長百分比上主效應顯著（F時間=218.58、P時間＜0.001，F(xiàn)方法=332.79、P方法＜0.001）。三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為 254.53、149.54、113.83、248.63、83.67、239.79、94.85、195.98，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比大于對照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長百分比小于溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2～3。

圖2 三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比比較Figure 2 Comparison of increased percentage of hind paws thickness in the three groups of mice 6 hours after modeling and 1 to 7 days after treatment

圖3 三組小鼠造模后6 h及治療后7 d足爪腫脹的典型圖片F(xiàn)igure 3 Typical pictures of hind paw swelling 6 hours after modeling and 7 days after treatment in the three groups of mice

2.3 IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為55.97、341.63、340.88，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量高于對照組（P＜0.01），DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量低于溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖4 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量比較Figure 4 Comparison of relative mRNA expression quantities of IL-1β，TNF-α and iNOS in the injected hind paw tissues in the three groups of mice 7 days after treatment

2.4 血尿酸濃度 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.11，P=0.002）；DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對照組、溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.001、0.003），而對照組與溶劑組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.154），見圖5。

圖5 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較Figure 5 Comparison of serum uric acid concentration in the three groups of mice 7 days after treatment

3 討論

中醫(yī)學理論認為，AGA屬“痹證”范疇，又稱“歷節(jié)”或“白虎歷節(jié)”，其病因病機為先天稟賦不足，或后天調攝不慎、飲食不節(jié)、恣飲瓊漿或嗜肥甘無度，或傷于情志飲食致使脾胃功能失調、腎精損傷，加之外感風、寒、濕三氣而為??；AGA急性發(fā)作期以濕熱蘊結型為主［19-20］。當歸拈痛湯源自《醫(yī)學啟源》，是清熱利濕、疏風清熱的代表方，“治濕熱為病，肢節(jié)煩痛……遍身疼，下注于脛，腫痛不可忍”，方中羌活勝濕透關利節(jié)、防風溫散經絡中濕邪為君藥；升麻、葛根引陰中之陽上行而升散，白術和中除濕，蒼術去皮膚腠理之濕，為臣藥；當歸活血散瘀止痛，黨參、（炙）甘草補脾益氣護胃，苦參、黃芩、知母、茵陳泄?jié)駸帷⒊?jié)煩痛，豬苓、澤瀉滲濕化飲，共為佐藥；（炙）甘草兼調和諸藥而為使。臨床研究發(fā)現(xiàn)，當歸拈痛湯是治療濕熱內蘊型AGA的驗方，可有效減輕急性炎性反應，療效與塞來昔布、秋水仙堿相當［21-22］。

現(xiàn)代藥理學研究表明，澤瀉能降低大鼠血尿酸濃度，其作用機制可能與抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性、減輕腎臟損傷、下調腎臟中腎臟尿酸鹽轉運體1的表達有關［23］；葛根有效成分葛根素不僅可通過調節(jié)免疫細胞、炎性因子、信號通路等發(fā)揮抗炎作用，還可通過抑制XOD活性、促進尿酸排泄而降低血尿酸濃度，具有抗AGA作用［24］；黃芩有效成分黃芩苷可有效抑制大鼠的XOD活性［25］。

目前，MSU混懸液局部注射誘導是研究AGA最常用的動物造模方法［26］，大鼠、雞、家兔是研究AGA最常用的造模動物。為尋找更為經濟和理想的AGA動物模型，筆者所在課題組結合國外文獻［18，27］而嘗試建立了C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關節(jié)周圍注射MSU混懸液誘導的AGA動物模型，并已證實其外在體征、發(fā)病機制、病理改變等與人AGA相似［28］。本研究首次應用上述模型探究當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，結果顯示：溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比大于對照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長百分比小于溶劑組，溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量高于對照組，DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量低于溶劑組，DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對照組、溶劑組，表明當歸拈痛湯可有效緩解AGA小鼠足爪炎性腫脹程度，下調炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表達，降低血尿酸濃度。此外，本研究還對三組小鼠治療前后體質量進行了組間和組內比較，但均未發(fā)現(xiàn)顯著差異，提示造模方法及當歸拈痛湯對小鼠體質量無明顯影響，安全、可行。因此，筆者認為當歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調節(jié)炎性因子的表達、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個核心問題的有效方劑且安全性較高。

作者貢獻：陳紹華負責實驗動物的飼養(yǎng)與處理，數(shù)據分析，論文撰寫與修改；陳紹華、梁倩倩對文章整體負責，監(jiān)督管理；王沁筠、吳昌桂、趙嘯負責實驗動物取材、觀察指標測定、數(shù)據整理；徐浩負責圖像采集；施杞、梁倩倩負責研究的設計與可行性分析。

本文無利益沖突。