趙 聰，范文來*，徐 巖

（教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

醬具有獨特的色、香、味、形，是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡恼{(diào)味品[1]。醬通常以黃豆、蠶豆、面粉、辣椒為主要原料，通過微生物發(fā)酵而成，富含多種風味物質(zhì)。郫縣豆瓣醬是我國一種獨特的發(fā)酵調(diào)味醬，別稱蠶豆醬、豆瓣辣醬或蠶豆辣醬，是烹飪川菜必不可少的調(diào)味品[2]。郫縣豆瓣醬是以蠶豆、辣椒、面粉和鹽為原料，其生產(chǎn)過程包括辣椒到辣椒醅發(fā)酵、蠶豆到蠶豆餅曲發(fā)酵及辣椒醅與蠶豆餅曲混合發(fā)酵3 個階段；其他發(fā)酵調(diào)味醬的原料主要是大豆、面粉和鹽，其生產(chǎn)過程包括制曲和加鹽水發(fā)酵晾曬2 個階段[3-4]。由于原料與工藝的差別，郫縣豆瓣醬與其他豆瓣醬相比更具鮮辣香醇、紅潤光艷、黏稠絨實、醬香濃郁的產(chǎn)品特色，深受廣大消費者的喜愛。

醬的風味是衡量醬品質(zhì)的重要指標之一。近年來，隨著風味研究技術(shù)的應(yīng)用，對發(fā)酵調(diào)味醬的風味研究日益深入。趙建新等[5]采用頂空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-聞香（gas chromatography-olfactometry，GC-O）分析傳統(tǒng)醬的香氣活性物質(zhì)；Zhao Jianxin等[6]采用HS-SPME結(jié)合香氣稀釋萃取（aroma extraction dilution，AED）分析自然發(fā)酵與接種發(fā)酵醬的香氣物質(zhì)；Zhang Yan等[7]采用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）結(jié)合AED分析醬的香氣物質(zhì)；劉平等[8]采用SDE結(jié)合香氣活性值法表征郫縣豆瓣醬的特征香氣；Lin Hongbin等[9]采用水溶萃取提取醬的香氣物質(zhì)。上述研究主要集中于香氣物質(zhì)的提取與鑒定，這些方法能否最大程度提取醬的特征香氣物質(zhì)，并沒有驗證，因此在香氣特征方面難以建立工業(yè)標準。

本研究分別采用水、乙醚和二氯甲烷萃取豆瓣醬的香氣化合物，通過比較萃取液氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）圖譜峰的數(shù)量和豐度結(jié)合感官品評結(jié)果，選擇最適的香氣提取方法；并將萃取液分酸-水溶性組分和中-堿性組分，結(jié)合GC-O和GC-MS技術(shù)對郫縣豆瓣醬的香氣貢獻進行解析，確定郫縣豆瓣醬的重要香氣化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣醬由四川省郫縣豆瓣股份有限公司提供。

無水乙醚、Na2SO4、NaCl、H2SO4、NaHCO3（均為分析純） 中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司；二氯甲烷和標準品（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 6890N-MSD 5975型GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Gerstel ODP2聞香裝置 德國Gerstel公司；N-EVAP111型氮吹儀 美國Organomation公司；DB-FFAP色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 上海安譜科學儀器有限公司；Mili-Q超純水儀 美國Millipore公司；SB-5200D超聲波清洗儀 天津Autosciennce公司；VL-3000A攪拌機 中山市小欖鎮(zhèn)威的電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品均質(zhì)化與浸提

將豆瓣醬樣品置于攪拌機攪拌粉碎后，分別稱取100 g粉碎的樣品于離心管中，分別加入200 mL煮沸冷卻的超純水、重蒸無水乙醚和重蒸二氯甲烷，密封、渦振2 min后，20 ℃超聲20 min；4 ℃、10 000 r/min離心5 min，收集上清液，乙醚萃取液記為“萃取相I”。

1.3.2 萃取相分餾

由于醬體系較為復雜，為了避免GC-MS分析時分離不佳和便于GC-O分析，需將萃取相按pH值分成酸-水溶性和中-堿性組分，便于香氣物質(zhì)的分離和鑒定。參考Qian等[10]報道的香氣物質(zhì)提取方法，在“萃取相I”中加入100 mL煮沸冷卻的超純水與適量NaCl飽和，用10% NaHCO3溶液調(diào)pH值至9.0，靜置分層，收集水相，用20 mL超純水洗滌有機相2 次，水洗液與水相合并，記為“萃取相II”，有機相記為“萃取相III”，“萃取相III”即為中-堿性組分?！拜腿∠郔I”加無水NaCl飽和，用2 mol/L H2SO4溶液調(diào)pH值至2.0，用60 mL重蒸乙醚萃取3 次，合并有機相，記為“萃取相IV”，即為酸-水溶性組分。在“萃取相III”與“萃取相IV”中加無水Na2SO4置于－20 ℃冰箱中干燥過夜，分別濃縮至250 μL，用于GC-O和GC-MS分析。

1.3.3 描述性分析

感官培訓參考文獻[11]進行。感官品評小組由從事風味研究的10 名研究生組成（6 男4 女），品評員定期參加感官培訓（每周至少1 次，持續(xù)半年），所有感官訓練均在20 ℃的感官品評室中進行。品評人員分別對豆瓣醬原樣、乙醚萃取液、水萃取液及二氯甲烷萃取液進行感官評定，共產(chǎn)生6 個典型香氣屬性表征樣品的感官特性。品評人員對每個屬性的評分范圍為0～5，5為最高強度，0為最低強度，每個樣品的每個屬性最終得分為10 次品評的平均分。

1.3.4 GC-O分析

參考Xu Yan等[12]的時間強度法，挑選2 名經(jīng)過聞香訓練的碩士研究生進行GC-O分析，同時記錄保留時間、香氣特征和香氣強度。香氣強度采用0～5共6 個等級，“0”表示未聞到香氣，“3”表示香氣中等，“5”表示香氣非常強。每個組分每人聞3 次，每個化合物的香氣強度為6 次聞香強度的平均值。

1.3.5 GC-MS分析

GC條件：色譜柱為DB-FFAP（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為He；流速2 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣；升溫程序：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫至230 ℃，并保持15 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～350 u。

1.3.6 定性分析

未知香氣化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）根據(jù)改進的Kovats法計算得到[13]?；衔镔|(zhì)譜與NIST 05 a.L數(shù)據(jù)庫中標準譜圖比對，定性結(jié)果將化合物RI、香氣描述與標準品的RI和香氣描述比對確認。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣化合物提取劑的選擇

如圖1所示，乙醚萃取液揮發(fā)性化合物總離子流圖（圖1a）的峰數(shù)量最多，且化合物的豐度最高；水萃取液揮發(fā)性化合物總離子流圖（圖1b）的峰數(shù)量最少，化合物的豐度次之。

圖1 乙醚萃取液（a）、水萃取液（b）和二氯甲烷萃取液（c）揮發(fā)性化合物總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds present in ether extract (a), water extract (b), and dichloromethane extract (c)

如圖2所示，確定6 個典型香氣屬性（醬香、糟香、焦糖香、烘焙香、煙熏、香辛料）表征樣品的感官特性。水萃取液香氣輪廓與原醬樣香氣輪廓差異明顯，醬香、香辛料與原醬樣差異較大。乙醚萃取液香氣輪廓與原醬樣香氣輪廓差異最小，6 個香氣屬性都比較接近。二氯甲烷萃取液香氣輪廓與原醬樣香氣輪廓差異也較小，但醬香與烘焙香較乙醚提取差，萃取效果沒有乙醚好。

圖2 原豆瓣醬樣品與3 種萃取液香氣輪廓圖Fig.2 Aroma profiles of Pixian bean paste and three extracts from it

綜上，經(jīng)GC-MS分析與感官品評結(jié)果表明，乙醚萃取液GC-MS圖譜峰的數(shù)量最多且豐度最高，乙醚萃取液與原醬樣的整體香氣輪廓最接近，因此選擇乙醚作為豆瓣醬香氣物質(zhì)的提取劑。

2.2 GC-O分析結(jié)果

通過GC-O聞香共鑒定到46 種香氣物質(zhì)，其中醇類5 種、揮發(fā)性有機酸類13 種、醛酮類7 種、酚類11 種、芳香族類5 種、雜環(huán)類3 種以及吡嗪類2 種。

2.2.1 酸-水溶性組分

如表1所示，在酸-水溶性組分中共鑒定到33 種香氣化合物，主要為揮發(fā)性有機酸類、酚類、醛酮類、芳香族和雜環(huán)類。

表1 郫縣豆瓣醬酸-水溶性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 1 Aroma intensities of acid-water soluble aroma compounds from Pixian bean paste

揮發(fā)性有機酸類13 種，揮發(fā)性有機酸的存在反映了郫縣豆瓣醬具有酸味、腐臭、奶酪的香氣特征。根據(jù)香氣強度值，乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸和4-甲基戊酸是重要的酸類物質(zhì)。乙酸（香氣強度4.2）香氣貢獻較大，是郫縣豆瓣醬最重要的酸類物質(zhì)，貢獻醋酸氣味。其次是3-甲基丁酸（香氣強度3.7）、3-甲基戊酸（香氣強度3.8）與4-甲基戊酸（香氣強度3.7）是郫縣豆瓣醬重要的酸類物質(zhì)，貢獻腐臭、奶酪、汗臭氣味。在日本味噌中鑒定到香氣貢獻較大的酸類物質(zhì)有乙酸與3-甲基丁酸[19]。在韓國大醬中發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性有機酸貢獻大小順序為丙酸、4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、乙酸、3-甲基丁酸[20]，而郫縣豆瓣醬中乙酸的貢獻相對于3-甲基丁酸對醬的風味貢獻更大。巴豆酸之前并未報道過，為首次鑒定，呈奶酪香氣。在發(fā)酵食品中，酸類物質(zhì)一般由細菌產(chǎn)生[21]。

酚類物質(zhì)8 種，反映郫縣豆瓣醬典型的煙熏、香辛料香氣特征。根據(jù)香氣強度值，苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚是重要的酚類物質(zhì)。苯酚（香氣強度3.7）、2,6-二甲氧基苯酚（香氣強度3.5）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（香氣強度3.4）是郫縣豆瓣醬最重要的酚類物質(zhì)，分別貢獻藥香、香辛料、煙熏氣味，其中2,6-二甲氧基苯酚為首次鑒定。愈創(chuàng)木酚（香氣強度3.3）和4-甲基愈創(chuàng)木酚（香氣強度3.2）是郫縣豆瓣醬重要的酚類物質(zhì)，貢獻煙熏、香草氣味。苯酚與愈創(chuàng)木酚是國內(nèi)醬重要的香氣組成[6]。愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚與4-乙基苯酚對日本味噌與韓國大醬的香氣貢獻較大[19,22]。苯酚、愈創(chuàng)木酚主要由一些細菌降解氨基酸生成[23]。

醛酮類物質(zhì)5 種，特別是呋喃酮類化合物使郫縣豆瓣醬具有典型的焦糖香氣特征。醛酮類化合物一般由氨基酸脫氨脫羧、酮酸脫羧、醇氧化等化學反應(yīng)生成[24]。2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮（香氣強度3.7）是一種重要的呋喃酮類化合物，呈焦糖香氣，曾有報道其是魯氏酵母的次級代謝產(chǎn)物[25]。2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮已經(jīng)在日本味噌中發(fā)現(xiàn)，是日本味噌中一種重要的香氣物質(zhì)[19]。首次在豆瓣醬中發(fā)現(xiàn)3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮與3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮，均呈焦糖香氣。

在酸-水溶性組分共鑒定到4 種芳香族化合物，反映郫縣豆瓣醬典型的花香香氣特征，其中2-苯乙醇（香氣強度3.6）與2-苯乙酸（香氣強度3.2）是郫縣豆瓣醬重要的芳香族化合物，貢獻玫瑰花香與甜香。在酸-水溶性組分鑒定到2-乙?；量? 種雜環(huán)類化合物，呈甜香，該化合物已經(jīng)在日本味噌中發(fā)現(xiàn)[22]。

2.2.2 中-堿性組分

如表2所示，在郫縣豆瓣醬的中-堿性組分共鑒定到20 種香氣化合物，主要是醇類、酚類、醛酮類、吡嗪類、雜環(huán)類和芳香族化合物。根據(jù)香氣強度值，1-辛烯-3-酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、2-糠醇、苯乙醇和丁子香酚是郫縣豆瓣醬重要的香氣化合物。

表2 郫縣豆瓣醬中-堿性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 2 Aroma intensities of neutral-alkaline aroma components from Pixian bean paste

在中-堿性組分鑒定到5 種醇類，反映郫縣豆瓣醬果香和甜香的香氣特征。2-糠醇（香氣強度3.5）是最重要的醇類物質(zhì)，呈焦糖香氣。在酸-水溶性與中-堿性組分均能檢測到3-甲硫基丙醇與2-甲基丙醇，分別呈土豆與指甲油氣味。相關(guān)研究認為醇類化合物主要來源于氨基酸[28]。

共鑒定到5 種酚類，主要呈煙熏和藥香。在酸-水溶性組分與中-堿性組分均能檢測到愈創(chuàng)木酚、苯酚與4-乙基苯酚。丁子香酚（香氣強度3.5）是最重要的酚類物質(zhì)，呈酚臭、丁香氣味。

在中-堿性組分中鑒定到3 種醛酮類。國內(nèi)外相關(guān)研究表明[6,19,22]，1-辛烯-3-酮（香氣強度3.6）具有較強的風味貢獻，呈蘑菇氣味，與本研究結(jié)果一致?？啡┏侍鹣?、杏仁香氣，對國內(nèi)醬的風味貢獻較大[6]。在豆瓣醬中鑒定到2 種吡嗪，反映郫縣豆瓣醬典型的烘焙、堅果香氣特征。2,6-二甲基吡嗪呈堅果、焙烤香氣，2-乙基-6-甲基吡嗪呈烤榛子香氣。吡嗪類化合物主要來源于微生物代謝或美拉德反應(yīng)生成[29-30]。本研究首次鑒定到γ-丁內(nèi)酯，呈焦糖香氣。在2 個組分中均能檢測到苯甲醇與2-苯乙醇，3,4-二甲基苯甲醛為首次鑒定，呈杏仁香氣。

3 結(jié) 論

本實驗采用水、乙醚和二氯甲烷3 種溶劑萃取豆瓣醬的香氣物質(zhì)，從萃取液GC-MS圖譜峰的數(shù)量和豐度以及感官品評結(jié)果看，乙醚為最合適的香氣物質(zhì)提取劑。將乙醚萃取液按酸堿性分離，然后聯(lián)用GC-O和GC-MS技術(shù)，全面解析豆瓣醬的香氣化合物。在郫縣豆瓣醬中鑒定到46 種香氣化合物，其中香氣強度較大的物質(zhì)有乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸、2-苯乙醇、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮、苯酚、1-辛烯-3-酮、2-糠醇和丁子香酚，這些化合物是郫縣豆瓣醬重要的香氣物質(zhì)。首次在郫縣豆瓣醬中鑒定到3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、巴豆酸、2,6-二甲氧基苯酚、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、γ-丁內(nèi)酯和3,4-二甲基苯甲醛6 個香氣化合物。本研究首次采用乙醚直接萃取醬的香氣物質(zhì)，并首次按酸堿性分離醬的香氣物質(zhì)，確定了郫縣豆瓣醬重要的香氣化合物，對進一步改進郫縣豆瓣醬的生產(chǎn)工藝、揭示郫縣豆瓣醬的發(fā)酵機理具有重要指導意義。