肖靜靜，何東初

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430070；2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

現(xiàn)代科技的進(jìn)步給人類帶來巨大的利益與幫助，但與此同時亦造成越來越多的化學(xué)致癌物進(jìn)入人類的生活和生產(chǎn)領(lǐng)域，可能對人類健康產(chǎn)生損害，而造血系統(tǒng)又是此類損傷主要的受累部位[1]。有害化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是造血細(xì)胞損傷的重要機(jī)制[2]，化學(xué)損傷后造血細(xì)胞及其微環(huán)境中活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生增加，超過體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除能力，機(jī)體則不能準(zhǔn)確地修復(fù)造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞中DNA損傷，導(dǎo)致造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞凋亡，造血祖細(xì)胞增殖減少，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞自我更新及定向分化能力下降，損傷骨髓基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致造血干細(xì)胞龕穩(wěn)態(tài)紊亂，最終導(dǎo)致骨髓抑制，骨髓衰竭[3]。造血細(xì)胞生長因子(hematopoietic growth factors,HGFs)對化學(xué)損傷導(dǎo)致的骨髓抑制具有一定的療效，但其價格昂貴，并且其也會影響造血干細(xì)胞功能，加重造血干細(xì)胞功能損傷[4]。因此，尋找有效改善造血功能且安全、經(jīng)濟(jì)、毒副作用小的治療藥物成為目前化學(xué)損傷領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。健脾補(bǔ)腎方(既往稱地甘口服液)在中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床應(yīng)用十余年，在防治輻射及化學(xué)損傷方面取得了滿意的療效。前期臨床試驗(yàn)表明該方能預(yù)防及治療腫瘤放化療患者外周血象的下降，改善造血功能，并且能提高患者的免疫功能[5-6]。前期動物實(shí)驗(yàn)表明該方能增強(qiáng)化學(xué)損傷小鼠骨髓細(xì)胞周期素基因(cyclinD1)和造血細(xì)胞及基質(zhì)黏附分子(CD45、VCAM-1)的表達(dá)，減少脾臟及骨髓相關(guān)凋亡基因(bcl-2、bax)表達(dá)，促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡等[7-12]。本研究觀察健脾補(bǔ)腎方對化學(xué)損傷小鼠造血細(xì)胞氧化損傷及造血細(xì)胞凋亡的影響，揭示其對化學(xué)損傷保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取8～12周健康純系小鼠60只，體重18～22 g，雌雄兼用，由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號:42000600004104。

1.2藥物 健脾補(bǔ)腎方由熟地黃、炙甘草、當(dāng)歸、黃芪、澤瀉、陳皮組成，由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中藥制劑室制備，經(jīng)水煎、過濾、濃縮后，制成100% 濃度(含生藥1 g/mL)和200% 濃度(含生藥2 g/mL)的藥液，分裝備用。鯊肝醇，廣州康和藥業(yè)有限公司，批號：20100725。

1.3主要試劑及儀器 DMEM、胎牛血清、胰酶(Trypsin-EDTA)，美國Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶，Corning公司；紅細(xì)胞分離液，武漢巴菲爾公司；淋巴細(xì)胞分離液，武漢巴菲爾公司；GM-SF、低熔點(diǎn)瓊脂糖、胎牛血清、谷氨酰胺；活性氧檢測試劑盒，碧云天公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；熒光酶標(biāo)儀，美國BioTek公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇12只作為正常組，其余小鼠采用環(huán)磷酰胺以100 mg/kg的劑量腹腔注射，每天1次，連續(xù)3 d。造模成功后將小鼠隨機(jī)分為模型組、健脾補(bǔ)腎方小劑量組、健脾補(bǔ)腎方大劑量組、鯊酐醇組各12只。模型組和正常組小鼠用生理鹽水灌胃，健脾補(bǔ)腎方小劑量組和健脾補(bǔ)腎方大劑量組分別用100%濃度健脾補(bǔ)腎方和200%濃度健脾補(bǔ)腎方灌胃，鯊酐醇組給予鯊肝醇混懸液0.1 g/kg灌胃，均0.2 mL/10 g，2次/d。于灌胃第9天處死各組小鼠，收集外周血、骨髓進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1外周血常規(guī)檢測 全自動血液分析儀測定外周血中白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平。

1.5.2骨髓細(xì)胞ROS水平檢測 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。分離骨髓單核細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個/mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。取正常標(biāo)記有DCFH-DA的細(xì)胞加入活性氧陽性對照刺激細(xì)胞，設(shè)濃度梯度為50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、0 mg/mL。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平。

1.5.3粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)檢測 采用體外單層瓊脂半固體培養(yǎng)法檢測：制備各組小鼠骨髓單核細(xì)胞懸液，培養(yǎng)體系包括50 ng/mL GM-CSF，20%胎牛血清，瓊脂終濃度為0.3%，4 mmol/L谷氨酰胺，配制2×105/mL細(xì)胞懸液。于37 ℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14 d觀察集落形成情況，以大于40個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為一個集落。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠外周血常規(guī)比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，健脾補(bǔ)腎方小、大劑量組外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白水平和鯊肝醇組外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平均明顯升高(P均<0.05)，鯊酐醇組血小板回升不顯著(P>0.05)；健脾補(bǔ)腎方小劑量組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于健脾補(bǔ)腎方大劑量組和鯊肝醇組(P均<0.05),接近正常水平。見表1。

表1 各組小鼠外周血常規(guī)比較

2.2各組小鼠骨髓細(xì)胞ROS水平和CFU-GM比較 與正常組比較，模型組小鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(P<0.05)，骨髓細(xì)胞 CFU-GM 明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，健脾補(bǔ)腎方小、大劑量組和鯊酐醇組骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低(P均<0.05)，骨髓細(xì)胞 CFU-GM 明顯增加(P均<0.05)，其中健脾補(bǔ)腎方小劑量組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于健脾補(bǔ)腎方大劑量組和鯊肝醇組(P均<0.05)，接近正常水平。見表2及圖1～5。

圖1 正常組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成情況

表2 各組小鼠骨髓細(xì)胞ROS水平和CFU-GM比較

3 討 論

化學(xué)損傷屬中醫(yī)“虛勞”“血虛證”范疇，病變涉及五臟。中醫(yī)認(rèn)為“脾為氣血生化之源”，“腎主骨，生髓藏精”，“血為精所化”。故腎虛則髓不足，精不足則血衰，說明脾、腎、骨髓和血液之間存在密切的關(guān)系，通過健脾補(bǔ)腎可達(dá)生血的目的。健脾補(bǔ)腎方重用熟地、甘草為君藥，其中熟地可滋陰補(bǔ)血，填精益髓;甘草可補(bǔ)益脾氣，益氣復(fù)脈。黃芪補(bǔ)脾肺之氣，以益生血之源;當(dāng)歸補(bǔ)血亦可活血，促進(jìn)祛瘀生新，共為臣藥。陳皮理氣健脾，行氣導(dǎo)滯，可防止補(bǔ)益藥之滋膩，為佐藥；澤瀉宣泄腎濁，引藥歸經(jīng)，為使藥。諸藥合用可健脾益氣、滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)血益髓?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地黃多糖可促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的增殖與分化，升高外周血象[13-14]。甘草能夠增強(qiáng)骨髓細(xì)胞增殖分化能力，刺激骨髓造血[15]。當(dāng)歸可顯著促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖，并延緩其衰老，促進(jìn)多種造血祖細(xì)胞的增殖、分化；當(dāng)歸多糖還可通過延緩骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰老，促進(jìn)黏附分子、血管生長因子、造血生長因子的分泌從而改善造血微環(huán)境來促進(jìn)造血功能的恢復(fù)[16]。黃芪能促進(jìn)輻射損傷小鼠造血干細(xì)胞的增殖和分化，能使損傷的脾臟向正常逆轉(zhuǎn)，并可清除輻射導(dǎo)致的氧化損傷，能夠改善因放化療引發(fā)的骨髓抑制狀態(tài)[17-18]。澤瀉能夠促進(jìn)放化療后組織損傷分解代謝產(chǎn)物的排泄[19]。陳皮可改善脾胃運(yùn)化功能，促進(jìn)造血營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善免疫功能，有抗腫瘤、抗突變作用[20]?？梢娊∑⒀a(bǔ)腎方具有促進(jìn)造血功能恢復(fù)的作用。

圖2 模型組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成情況

圖3 健脾補(bǔ)腎方小劑量組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成情況

圖4 健脾補(bǔ)腎方大劑量組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成情況

圖5 鯊酐醇組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成情況

外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平主要反映造血干/祖細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化的能力，CFU-GM 可反映造血干/祖細(xì)胞體外增殖能力，ROS升高是照射引起骨髓造血干/祖細(xì)胞損傷的重要因素。本研究采用環(huán)磷酰胺腹腔注射方法建立化學(xué)損傷模型，顯示化學(xué)損傷后小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平明顯降低，骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，骨髓細(xì)胞CFU-GM明顯減少，提示造模成功。與模型組比較，健脾補(bǔ)腎方小、大劑量組外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)和血紅蛋白水平明顯恢復(fù)，骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低，骨髓細(xì)胞CFU-GM明顯增加。說明健脾補(bǔ)腎方對化學(xué)損傷所致的造血系統(tǒng)分化異常有保護(hù)作用，可提高造血干/祖細(xì)胞的增殖分化能力，其保護(hù)作用可能是通過清除ROS，減輕造血系統(tǒng)的氧化損傷而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中，健脾補(bǔ)腎方小劑量組各指標(biāo)改善情況均優(yōu)于大劑量組，可能與健脾補(bǔ)腎方中大劑量熟地黃、甘草滋膩之性影響胃腸道吸收有關(guān)，這說明健脾補(bǔ)腎方在治療化學(xué)物質(zhì)所致的造血功能損傷時存在一定的量效關(guān)系，而非劑量越大越好的依賴關(guān)系，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。