唐 敏 程 靜 許雁祥 朱國磊 楊發(fā)忠

（西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650233）

植物激素水楊酸（SA）是一種廣泛存在于植物體中的小分子酚類物質(zhì)[1-2]，在植物體中主要通過異分支酸合酶（ICS）途徑和苯丙氨酸解氨酶（PAL）途徑合成[3]。SA 是植物體內(nèi)重要的免疫激素，對(duì)多種重要代謝過程起到調(diào)控作用，包括病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI），在這些植物先天免疫系統(tǒng)中，SA 發(fā)揮了重要作用[4]。在病原物入侵植株時(shí)，植物通常啟動(dòng)水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR），從而減少病原物侵染對(duì)植物造成的危害[5]。如月季（Rosa chinensis）受到月季白粉菌（Podosphaera pannosa）的侵染時(shí)，植物體內(nèi)SA含量上升，從而增強(qiáng)對(duì)白粉菌入侵的適應(yīng)性[6]。

與此同時(shí)，SA 也可以作為外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)多種植物對(duì)多種生物脅迫產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性。已有研究表明，同一植物上的病害和蟲害之間存在著寄主植物介導(dǎo)的間接的病蟲互作關(guān)系，而SA 是這種互作關(guān)系的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在這一過程中起著重要作用[7]。內(nèi)外源SA 均可能誘導(dǎo)植物在產(chǎn)生抗病性的同時(shí)增強(qiáng)植物對(duì)植食性害蟲的抗性。如外源SA 處理能增強(qiáng)番茄（Lycopersicon esculentum）植株對(duì)煙粉虱（Bemisia tabaci）的抗性[8]。在SA 的誘導(dǎo)作用下，植株次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，對(duì)害蟲產(chǎn)生間接防御[9]，可能釋放含特異性成分的揮發(fā)物，作為天然信息化合物，被昆蟲用于識(shí)別寄主植物的適合性，間接抵制昆蟲的危害[10]。其中，SA 誘導(dǎo)黃瓜（Cucumis sativus）產(chǎn)生具有驅(qū)避作用的萜烯類物質(zhì)，從而對(duì)西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的取食、產(chǎn)卵產(chǎn)生影響，使黃瓜植株對(duì)西花薊馬產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性[11]。

但是截至目前，仍不清楚外源水楊酸誘導(dǎo)是否能增強(qiáng)月季植株對(duì)甜菜夜蛾的抗性，同樣，SA處理月季后是否會(huì)誘導(dǎo)月季揮發(fā)性成分（VOCs）發(fā)生變化也是未知的。因此將采用外源SA 對(duì)月季植株進(jìn)行誘導(dǎo)，研究其對(duì)甜菜夜蛾的影響，并通過頂空動(dòng)態(tài)吸附法原位收集月季枝條的揮發(fā)物，通過GC?MS 分析明確其組成及含量變化，測試SA 誘導(dǎo)月季新合成的化合物對(duì)甜菜夜蛾是否具有生物活性，以期探明SA 誘導(dǎo)月季對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的化學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料來源和儀器試劑

1.1.1 植物與昆蟲

供試?yán)ハx甜菜夜蛾、供試植物月季幼苗均采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉種植基地用于切花月季（艷粉）生產(chǎn)的大棚中。

1.1.2 儀器與試劑

美國Agilent Technologies 公司HP6890GC/5973 MS 氣相色譜?質(zhì)譜（GC?MS）聯(lián)用儀；吸附劑為Porapak Q（80～100 目，Waters，USA）；正己烷和丙酮均為色譜純；水楊酸（SA）以及包括正構(gòu)烷烴在內(nèi)的所有用于GC?MS 分析和產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品（共40 種）購自百靈威公司，含量≥99%。

1.2 研究方法

1.2.1 月季栽培

將采回的健康無病蟲害的中國月季幼苗用基質(zhì)進(jìn)行栽培，進(jìn)行適時(shí)澆水、施肥、防病蟲害等正常管理，防止白粉菌侵染。培育條件為溫度27 ℃、濕度70%、光周期12 h/d，至嫩枝達(dá)30 cm左右用于實(shí)驗(yàn)中。

1.2.2 甜菜夜蛾飼養(yǎng)

甜菜夜蛾幼蟲采回后置于養(yǎng)蟲盒內(nèi)用月季葉片飼養(yǎng)至化蛹，待成蟲羽化后置于產(chǎn)卵籠內(nèi)交配、產(chǎn)卵，籠內(nèi)放置蘸10%蜂蜜水的棉球補(bǔ)充成蟲營養(yǎng)，放入健康月季枝條供其產(chǎn)卵。采集帶有即將孵化的卵塊的月季葉片，放入鋪有濕潤濾紙的養(yǎng)蟲盒中，并放入部分新鮮月季葉片，待卵孵化后自由取食。每天觀察，及時(shí)更換中國月季葉片。飼養(yǎng)條件為溫度27 ℃、濕度70%、光周期12 h/d。化蛹后轉(zhuǎn)入潤濕的土壤中保濕，以防止蛹失水過多而死亡。并嚴(yán)格認(rèn)真做好整個(gè)飼養(yǎng)過程中殺菌消毒的工作，防止甜菜夜蛾幼蟲受到核型多角體病毒或顆粒體病毒感染。

1.2.3 產(chǎn)卵測試I

SA 用少量乙醇溶解，并用v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑，稀釋至1 mmol/L[12]。選取健康無病蟲害的月季植株，用SA 溶液進(jìn)行葉面噴施，每天1 次，每株每次5 mL；對(duì)照組用相應(yīng)溶劑同法噴施。連續(xù)處理6、9、12 d 后，分別采集處理組和對(duì)照組枝條，各1 束，每束4 枝，插入有水的燒杯中。將兩束枝條對(duì)角放入用細(xì)鐵絲紗網(wǎng)自制的產(chǎn)卵籠中，分開50 cm，中間放置蘸有10%蜂蜜水的棉球，放入飛翔正常、雌雄配對(duì)的甜菜夜蛾成蟲4 對(duì)，讓其任意選擇在2 種枝條上產(chǎn)卵。實(shí)驗(yàn)開始后的第3 天、第5 天、第7 天分別記錄產(chǎn)卵量，記錄完畢更換同法處理的新鮮枝條，并計(jì)算產(chǎn)卵量的每雌均值，重復(fù)5 次。用總產(chǎn)卵量計(jì)算抑制指數(shù)（II）：

式中：OCK表示對(duì)照枝條上的產(chǎn)卵量，OT表示SA 處理后的枝條上的產(chǎn)卵量。

1.2.4 揮發(fā)性成分捕集

參照Giusto 等[13]的方法，采用動(dòng)態(tài)頂空吸附（DHSA）法，不將枝條剪下，在活體月季植株上對(duì)揮發(fā)性成分（VOCs）進(jìn)行原位捕集。將1 枝經(jīng)SA 處理6 d 后的枝條封入PET 袋（耐受溫度>200 ℃）中，從下部通入氣流?？諝饬飨冉?jīng)過活性炭、去離子水，再經(jīng)過裝有吸附劑Porapak Q的玻璃吸附管進(jìn)入袋中，并從PET 袋上部抽出、經(jīng)過第2 個(gè)Porapak Q 吸附管。進(jìn)出口氣流量分別為600 mL/min 和500 mL/min，以保證外界氣體不進(jìn)入PET 袋。收集時(shí)間8 h，完成后將第2 支吸附管取下，用5 mL 正己烷將月季釋放的VOCs混合物從吸附劑上洗脫下來，?80 ℃保存?zhèn)溆?。共? 枝枝條上收集，合并捕集物，實(shí)驗(yàn)前N2頂吹濃縮，用于GC?MS 分析和產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)。SA 處理9、12 d 后的枝條 以及對(duì)照植株的VOCs 同 法收集。

1.2.5 產(chǎn)卵測試II

將1.2.4 中分別從SA 處理過的植株和對(duì)照植株收集的VOCs 用v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑分別稀釋至5 mL。選取健康無病蟲害、未經(jīng)任何處理的月季枝條2 束，分別用2 種VOCs 稀釋液噴施，并按照1.2.3 中的方法進(jìn)行產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 GC?MS 分析

采用GC?MS 法分析兩類月季VOCs 混合物中各物質(zhì)的組成和含量，并采用相同方法進(jìn)行背景扣除（不放入月季枝條）。GC 條件：HP?5 MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫：起始溫度40 ℃，程序升溫3 ℃/min 至80 ℃，再程序升溫5 ℃/min 至260 ℃；氣流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量2.0 μL；不分流，載氣為高純氦氣。MS 條件：電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.2.7 單體活性測試

根據(jù)GC?MS 結(jié)果選擇需要進(jìn)行活性測試的化合物，這類化合物在正常月季植株中不會(huì)合成，只有在SA 的誘導(dǎo)作用下才會(huì)合成出來的新化合物，可能在月季抗蟲過程中起到重要作用。將所選化合物配制成0.1、0.5、2.5、12.5 mg/mL溶液（v（乙醇）∶v（水）為1∶3 的溶劑），按1.2.5 的方法噴施到2 束月季枝條上同法進(jìn)行產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制指數(shù)II。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)GC?MS 檢測結(jié)果，對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品的40 種化合物采用外標(biāo)法定量；對(duì)未能購買到標(biāo)準(zhǔn)品的4 種化合物，選擇保留時(shí)間與之最相近的正構(gòu)烷烴作為外標(biāo)物進(jìn)行定量。結(jié)果用每小時(shí)內(nèi)每克新鮮嫩枝釋放的揮發(fā)物的質(zhì)量（ng/(g·h)）表示。定性鑒定方法：1）通過GC?MS 檢測所得信息和wiley7n.l 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比較；2）根據(jù)正構(gòu)烷烴計(jì)算出目標(biāo)化合物的科瓦茨指數(shù)并與文獻(xiàn)比較；3）與NIST 數(shù)據(jù)庫在相同分析條件下的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；4）與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照。

產(chǎn)卵量差異統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0（IBM?SPSS，USA）中的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸誘導(dǎo)對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響

直接采用水楊酸（SA）處理過的月季枝條及對(duì)照枝條進(jìn)行甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為生物測試，所得結(jié)果如圖1 所示，圖1 中A、B、C 分別為SA 處理6、9、12 d 的枝條。從該結(jié)果可以看出，SA誘導(dǎo)了月季植株對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，使雌蛾在SA 處理后的植株上產(chǎn)卵量明顯減少。從總產(chǎn)卵量來看，處理6、9、12 d 后，產(chǎn)卵量與對(duì)照相比均顯著下降，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。根據(jù)總產(chǎn)卵量計(jì)算，處理6、9、12 d 對(duì)應(yīng)的抑制指數(shù)II分別為35.4%、38.9%、47.5%，隨著處理時(shí)間延長，II增加，抑制作用存在明顯的時(shí)間效應(yīng)，亦即，SA 處理對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的抑制作用增強(qiáng)。從產(chǎn)卵開始后的各時(shí)間段來看，除了圖1a 中產(chǎn)卵時(shí)間為7 d 時(shí)的產(chǎn)卵量外，其他各時(shí)段的產(chǎn)卵量與對(duì)照相比均存在顯著性差異（包括圖1a?c）。

圖1 SA 誘導(dǎo)月季植株對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.1 Effect of induction of R.chinensis plants by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

與此同時(shí)，先將SA 處理的植株和對(duì)照植株頂空VOCs 提取出來，再將VOCs 混合物配成溶液噴施兩束相同的未經(jīng)處理的健康月季枝條，讓甜菜夜蛾自由選擇在噴施后的2 種月季枝條上產(chǎn)卵，測試SA 處理的月季VOCs 對(duì)產(chǎn)卵行為的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 SA 誘導(dǎo)的月季頂空揮發(fā)性成分混合物對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.2 Effect of the mixtures of headspace R.chinensis volatiles induced by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

從圖2 可以看出，在噴施了SA 處理后提取的揮發(fā)物的枝條上甜菜夜蛾的產(chǎn)卵量與對(duì)照相比顯著減少。SA 處理后月季揮發(fā)物對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為具有明顯的抑制作用，隨著處理時(shí)間延長，抑制作用增強(qiáng)，與對(duì)照相比差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。SA 處理6、9、12 d 后揮發(fā)物對(duì)產(chǎn)卵行為的抑制指數(shù)II分別為23.9%、25.4%、36.2%（根據(jù)總產(chǎn)卵量計(jì)算），也表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)。

綜合圖1 和圖2 的結(jié)果來看，SA 處理誘導(dǎo)月季對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為產(chǎn)生了明顯抑制作用，主要原因是SA 誘導(dǎo)了月季VOCs 變化，這種變化能被甜菜夜蛾成蟲明顯地識(shí)別出來，從而避免在SA 處理過的月季上產(chǎn)卵。結(jié)果表明SA 誘導(dǎo)的月季VOCs 變化在甜菜夜蛾產(chǎn)卵地選擇過程中起到重要作用。

2.2 GC?MS 分析

GC?MS 分析結(jié)果（表1）表明，SA 處理誘導(dǎo)了月季揮發(fā)性成分（VOCs）顯著變化。從化合物種類看，未經(jīng)處理的月季頂空VOCs 主要包含萜類（52.43%）、醛類（25.38%）、芳香族類（17.12%）、烴類（3.73%）；SA 處理6 d 后主要包含萜類（28.85%）、芳香族類（24.11%）、醛類（22.73%）、酯類（8.42%）；9 d 后主要包含萜類（42.75%）、芳香族類（15.70%）、醛類（14.96%）、酯類（9.10%）；12 d 后主要包含萜類（32.83%）、醇類（15.38%）、芳香族類（13.80%）、羧酸類（11.41%）。其中，含量變化最大的是醇類，SA 處理12 d 后與對(duì)照相比增加了5.85 倍，從對(duì)照的2.63%增加到15.38%；而萜類則從對(duì)照的52.43% 下降到32.83%，僅為對(duì)照的2/3 左右。

表1 SA 誘導(dǎo)的月季植株揮發(fā)性成分變化Table 1 Change of SA?induced volatiles released by R.chinensis plants

從單體化合物看，SA 誘導(dǎo)12 d 后，有10 種單體消失（未檢出）；21 種單體含量下降，其中，β?石竹烯、(E)?2?己烯?1?醇、β?欖香烯、芳樟醇與對(duì)照相比下降程度最大，分別下降了89.68%、76.25%、72.08%、65.07%；5 種化合物含量上升，其中，十六烷上升了118.77%、α?松油醇上升了92.71%；新增單體化合物8 種（在CK 中未檢出），其中，十四烷醇從CK 中的0.00%增加至12.94%，增幅最大。

簡言之，SA 誘導(dǎo)的月季植株頂空揮發(fā)物最明顯的變化是β?石竹烯釋放量減少，以及誘導(dǎo)植株新合成了十四烷醇。

另外，在8 種SA 誘導(dǎo)新增的化合物中，十四烷醇、2?乙基己酸、棕櫚酸甲酯和乙酸十六酯這4 種化合物，處理12 d 后的含量分別為12.94%、11.41%、6.02%、5.32%，在所有新增化合物中含量最大。4 種化合物的含量均隨著SA 處理時(shí)間的延長而逐漸增加，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)（如圖3 所示）。

圖3 SA 誘導(dǎo)4 種月季單體揮發(fā)物含量變化的時(shí)間效應(yīng)Fig.3 Temporal effect of the changes in contents of 4 SA?induced monomer volatile in R.chinensis

2.3 單體化合物對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響

將SA 誘導(dǎo)月季新合成的4 種單體化合物（十四烷醇、2?乙基己酸、棕櫚酸甲酯和乙酸十六酯）配置成溶液，噴施于健康枝條上測試它們對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響，結(jié)果如圖4 所示?？梢钥闯?，隨著4 種單體的濃度增加，抑制指數(shù)II增加，表明它們對(duì)產(chǎn)卵的抑制作用增強(qiáng)，顯示出明顯的濃度效應(yīng)，表明它們都有較強(qiáng)的活性。其中，十四烷醇的活性最強(qiáng)，在較低濃度下就對(duì)產(chǎn)卵產(chǎn)生了較強(qiáng)的活性，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，抑制指數(shù)就已超過35%。其他3 種化合物則在施用濃度大于2.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)甜菜夜蛾的產(chǎn)卵行為產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖4 SA 誘導(dǎo)的4 種單體活性成分對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的影響Fig.4 Effect of 4 SA?induced active mono-chemicals on ovipositional behaviour of S.exigua

3 結(jié)論與討論

用外源水楊酸（SA）處理月季植株可使植株產(chǎn)生對(duì)甜菜夜蛾的誘導(dǎo)抗性，從化學(xué)機(jī)理角度看，主要與月季揮發(fā)性成分變化有關(guān)。結(jié)果表明，SA 處理能使甜菜夜蛾在植株上的產(chǎn)卵量顯著減少，隨著處理時(shí)間延長，對(duì)產(chǎn)卵的抑制作用也增強(qiáng)；在噴施了從處理植株上提取的揮發(fā)性成分混合物的枝條上，產(chǎn)卵量顯著減少；處理6、9、12 d 后，抑制指數(shù)分別為23.9%、25.4%、36.2%。據(jù)此，從化學(xué)機(jī)理角度看，揮發(fā)性成分變化是SA 誘導(dǎo)抗性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通常認(rèn)為，植物體內(nèi)SA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與植物抗病性有關(guān)[2]。但是近年來，也有研究表明SA處理增強(qiáng)了植株的抗蟲性[8]。SA 處理能夠誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，從而間接地對(duì)昆蟲的危害產(chǎn)生抗性。這其中，植物揮發(fā)性成分（VOCs）起到了重要作用[8]。已有研究表明，白粉菌侵染月季能夠誘導(dǎo)植株對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，原因同樣與VOCs 有關(guān)，與SA 誘導(dǎo)的抗性十分類似。白粉菌誘導(dǎo)了月季VOCs 變化，誘導(dǎo)產(chǎn)生的VOCs混合物對(duì)甜菜夜蛾有十分明顯的驅(qū)避作用[14]。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在白粉菌?月季?甜菜夜蛾組成的三元系統(tǒng)中，SA 途徑在寄主植物介導(dǎo)的間接的病蟲互作過程中起到了重要作用。

GC?MS 結(jié)果表明，SA 處理誘導(dǎo)了月季VOCs發(fā)生了顯著變化，既有物質(zhì)種類的變化，也有含量的變化。也有研究表明還可能僅僅是2 種化學(xué)成分的比例發(fā)生變化[15]。這些化學(xué)信息常常被正在尋找產(chǎn)卵地的昆蟲做為天然信息化合物，用于識(shí)別寄主植物適合性，從而增加后代的成活率（即“媽媽知道理論”）[16-17]。從結(jié)果來看，甜菜夜蛾能夠明顯地識(shí)別出SA處理過的月季植株，寧愿在未處理過的植株上產(chǎn)卵，而避免SA 處理過的月季植株。原因包括，一是具有引誘活性的成分含量下降，如SA 誘導(dǎo)了芳樟醇和β?欖香烯含量下降；二是具有驅(qū)避活性的單體化合物在SA 的誘導(dǎo)作用下被月季合成出來，甜菜夜蛾能夠準(zhǔn)確識(shí)別這些天然信息化合物，并避免在釋放這些化合物的植株上產(chǎn)卵。其中，SA 誘導(dǎo)月季新合成的具有驅(qū)避活性的化合物有4 種，包括2?乙基己酸、十四烷醇、棕櫚酸甲酯、乙酸十六酯，在未處理的月季植株中正常情況下不會(huì)合成，但在SA 的誘導(dǎo)作用下能夠合成，具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，并且隨著處理時(shí)間的延長，含量增加，這類化合物最有可能被甜菜夜蛾做為信息化合物用于識(shí)別寄主植物是否適合繁衍生息；結(jié)果正好表明它們對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為有明顯的驅(qū)避作用。并且，產(chǎn)卵生物測試結(jié)果也表明，這4 種化合物對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)卵行為的抑制作用表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。而在這4 種化合物中，驅(qū)避活性最強(qiáng)的是十四烷醇。白粉菌侵染月季也誘導(dǎo)了十四烷醇含量顯著上升[6]，只是之前的研究未證實(shí)其對(duì)甜菜夜蛾有驅(qū)避活性。所得結(jié)果不僅闡明了SA 誘導(dǎo)月季對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的化學(xué)機(jī)理，也進(jìn)一步表明，白粉菌侵染月季誘導(dǎo)植株對(duì)甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性，與SA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

本研究結(jié)果還表明，SA 可以用于月季上的甜菜夜蛾的防治。同時(shí)，SA 誘導(dǎo)的月季揮發(fā)性成分混合物以及十四烷醇等單體化合物也可用于該蟲防治。這些物質(zhì)來源于天然，在自然界有著完整的降解途徑，可用于植物保護(hù)，可實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的綠色無公害防治。