黃清鏵 ，黃俊生 ，黃冬婷 ，黎鵬 ，謝建偉，孟飛 *

1. 廣東省科學(xué)院生物工程研究所（廣州 510316）；2. 廣東省生物材料工程技術(shù)研究中心（廣州 510316）；3. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院（永州 425199）

世界衛(wèi)生組織（WHO）在《2018世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告》（World Health Statistics 2018）[1]中指出，非傳染性疾病死亡人數(shù)約占總死亡人數(shù)的71%，其中心腦血管疾病排第一。中國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2.7億人，占中國(guó)每年總死亡病因的51%。血脂代謝紊亂是心腦血管疾病的主要原因[2]。臨床應(yīng)用的降膽固醇藥主要為他汀類藥物。然而，他汀類藥物會(huì)對(duì)部分患者造成肝臟功能和骨骼肌損害，甚至有誘發(fā)骨骼肌溶解導(dǎo)致患者死亡的危險(xiǎn)，此外還有可能導(dǎo)致血糖異常和誘導(dǎo)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

多廿烷醇（Policosanol），是由多個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪族伯醇（C20～C36）組成的混合物[4]。據(jù)報(bào)道，該類化合物具有減少血小板聚集和內(nèi)皮損傷，降低膽固醇、抗炎等多種生理活性[5-6]，特別是能有效降低高膽固醇血癥患者的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量，并提高高密度脂蛋白膽固醇的含量，減少動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)，且安全性非常好。因此，多廿烷醇是一種預(yù)防和治療高膽固醇血癥和其它一些心血管疾病的安全有效藥物。

多廿烷醇絕大部分是以脂肪酸酯的形態(tài)存在于蔗蠟、蜂蠟、糠蠟、小麥胚芽油、高粱、花生、向日葵籽仁、蟲(chóng)蠟等天然產(chǎn)物中，在一些食物的葉、果實(shí)和種子中也有廣泛存在[7]。中國(guó)甘蔗種植面積大，品種多，蔗蠟資源豐富，是制備多廿烷醇的優(yōu)質(zhì)天然原料[8]。眾所周知，甘蔗品種和產(chǎn)地的差異必然會(huì)導(dǎo)致蔗蠟成分的差異，從而使得多廿烷醇中各脂肪醇的組成和含量也有不同。蔗蠟多廿烷醇多數(shù)是從蔗渣和濾泥中獲得[9]。然而，濾泥雜質(zhì)多，糖分高，易發(fā)酵，導(dǎo)致部分蔗蠟分解，原料不易儲(chǔ)存等；另外，增加有機(jī)溶劑使用量且部分雜質(zhì)容易進(jìn)入終端產(chǎn)品，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，從而很難應(yīng)用到藥品及保健品等高端領(lǐng)域?；诖?，試驗(yàn)選取廣東產(chǎn)地的3種不同品種的蔗蠟，從未收割的甘蔗上，直接收集表皮和莖上的蔗蠟，探討其多廿烷醇的提取方法，并通過(guò)氣相色譜（GC）對(duì)各樣品中的脂肪醇種類和含量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Perkin Elmer Claru S680氣相色譜儀。

粗蔗蠟原料：在廣東省翁源縣甘蔗場(chǎng)，在未收割的甘蔗上，直接用砂紙現(xiàn)場(chǎng)刮取22、356和727這3種甘蔗品種的蠟質(zhì)，存放于先前準(zhǔn)備的樣品袋中。將砂紙浸泡在無(wú)水乙醇中，將蔗蠟從砂紙上刷下，減壓濃縮蒸去乙醇，烘箱中60 ℃下干燥4 h，得3種蔗蠟樣品，分別命名為22號(hào)、356號(hào)和727號(hào)。

正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇（均為分析純，Adamas試劑公司）；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蔗蠟的精制

稱取5 g粗蔗蠟，置于50 mL圓底燒瓶中，加入25 mL 95%乙醇，升溫至90 ℃待粗蔗蠟完全溶解，并在此溫度下保持回流1 h。靜置冷卻后溶液分層，傾倒出上層析出物，抽濾并用95%冷乙醇洗滌2～3次，收集固體于60 ℃下烘干6 h，得灰白色精制蔗蠟。

1.2.2 皂化和萃取

稱取1 g精制蔗蠟，加入到圓底燒瓶中，加入15 mL無(wú)水乙醇和0.14 g NaOH，在90 ℃下攪拌回流4 h后至皂化結(jié)束。將反應(yīng)液冷卻至60 ℃時(shí)，向其中加入30 mL石油醚攪拌萃取40 min后，加入同體積的預(yù)先加熱到60 ℃的蒸餾水，繼續(xù)攪拌20 min。分出石油醚層，減壓旋蒸去除石油醚，得多廿烷醇粗品。

1.2.3 粗醇的脫色和精制

取1 g粗醇置于50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇后升溫至80 ℃，待粗醇全部溶解后回流攪拌20 min。加入50 mg活性炭繼續(xù)回流攪拌5 min脫色，趁熱過(guò)濾，用70 ℃的熱乙醇洗滌活性炭2～3次。母液濃縮至20 mL，緩慢冷卻，析出白色固體，為精制多廿烷醇。

1.2.4 多廿烷醇的成分分析

1.2.4.1 氣相色譜分析條件

FID火焰離子化檢測(cè)器、HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm）毛細(xì)管柱、分流進(jìn)樣器溫度280 ℃、氣化室溫度300 ℃、檢測(cè)器溫度300 ℃；程序升溫：初始溫度180 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持12 min；載氣（N2）流速45.0 mL/min；氫氣（H2）流速40.0 mL/min；助燃?xì)猓ˋir）流速450 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；峰面積定量法。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取20 mg正二十六烷醇、20 mg正二十八烷醇、30 mg正三十烷醇和40 mg正三十二烷醇標(biāo)樣，分別加入到10 mL容量瓶中，用CHCl3溶解定容，制得2 mg/mL正二十六烷醇、2 mg/mL正二十八烷醇、3 mg/mL正三十烷醇和和4 mg/mL正三十二烷醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別移取0.10，0.25，0.50，1.00和2.00 mL 4種烷醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用CHCl3定容，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度梯度見(jiàn)表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度

1.2.4.3 3種多廿烷醇樣品分析

將制得的3種多廿烷醇分別取樣溶于CHCl3溶液，分別配制成500 μg/mL濃度，經(jīng)GC檢測(cè)3次，取其平均值。根據(jù)出峰時(shí)間、積分面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其高級(jí)脂肪醇種類和含量。

1.2.5 多廿烷醇的成分分析

統(tǒng)計(jì)分析：所得結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），LSD，S-N-K和Tukey s-b檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種蔗蠟精制產(chǎn)率

蔗蠟主要由蠟狀類脂物及脂肪狀類脂物組成，其中蠟狀類脂物垂直立于甘蔗莖、節(jié)的表皮上；而脂肪狀類脂物，則存在于甘蔗莖的內(nèi)部，是植物細(xì)胞原生質(zhì)的主要組成成分。在蠟狀類脂物的收集過(guò)程中，一些機(jī)械雜質(zhì)、灰塵泥土等也會(huì)進(jìn)入樣品，因此需要對(duì)其進(jìn)行精制。首先將粗蔗蠟溶于乙醇，在回流溫度下攪拌充分溶解，冷卻析出，收集最上層蔗蠟，去除燒瓶最底部機(jī)械雜質(zhì)、濾泥灰質(zhì)及膠質(zhì)等和中間層蔗脂。3種不同品種的蔗蠟精制產(chǎn)率如表2所示，22號(hào)蔗蠟產(chǎn)率最高，為83.7%，356號(hào)最低，從產(chǎn)率結(jié)果可以看出3個(gè)品種精制蔗蠟產(chǎn)率相差不大。精制后蔗蠟的外觀由褐色變?yōu)榛野咨?/p>

表2 蔗蠟精制產(chǎn)率

2.2 蔗蠟的皂化、萃取和粗醇的脫色、精制

精制蔗蠟中主要為由長(zhǎng)鏈一元脂肪醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸所形成的烷基酯。在皂化過(guò)程中，烷基酯水解得到相應(yīng)的一元脂肪醇，即為多廿烷醇；而相應(yīng)的脂肪酸則與過(guò)量的堿形成羧酸鹽溶于乙醇-水溶劑中。皂化結(jié)束后，用石油醚萃取、濃縮，得多廿烷醇粗品，得率在42.5%～50.2%之間，其中22號(hào)得率最高。將粗品進(jìn)行活性炭脫色和冷卻結(jié)晶處理，得精制多廿烷醇，為白色固體，其得率在45.6%～50.3%之間，其中727號(hào)得率最高（表3）。

表3 多廿烷醇精制產(chǎn)率

2.3 精制多廿烷醇成分分析

2.3.1 各高級(jí)脂肪醇的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線及色譜圖

正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇和正三十二烷醇混合色譜圖見(jiàn)圖1。以各高級(jí)脂肪醇為橫坐標(biāo)，氣相色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得各烷醇回歸方程：正二十六烷醇，y=4 403.1x-9 884.2，R2=0.999 9；正二十八烷醇，y=4 145.7x-5 516.5，R2=1；正三十烷醇，y=4 992.9x-14 040，R2=0.999 8，正三十二烷醇，y=5 132.1x-14 095，R2=0.999 7。

2.3.2 3種多廿烷醇樣品分析結(jié)果

3種精制烷醇的色譜圖如圖3～圖5所示，組成及含量分析如表4和表5所示。結(jié)果顯示，3種精制烷醇中，均未檢測(cè)到正三十二烷醇；3種精制烷醇樣品中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇總含量占樣品質(zhì)量比的80%以上，其中，356號(hào)比例最高，為89.18%±1.52%。三個(gè)品種精制烷醇中均含有少量三十烷醇，比例約4%；3種精制烷醇中正二十八烷醇和正三十烷醇含量較高，其中以正二十八烷醇為主要成分，22號(hào)和727號(hào)中正二十八烷醇和正三十烷醇含量相近（p＞0.05），356號(hào)中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇最高，顯著高于22號(hào)和727號(hào)（p＜0.05）。3種精制烷醇中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇含量比值相近，約4∶16∶1。

圖1 正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇的混合物色譜圖

圖2 正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇的混合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 22號(hào)多廿烷醇色譜分析圖

圖4 356號(hào)多廿烷醇色譜分析圖

圖5 727號(hào)多廿烷醇色譜分析圖

表4 樣品檢測(cè)含量及比例

表5 方差分析

3 討論與結(jié)論

從3種廣東產(chǎn)的甘蔗品種（22、356和727號(hào)）的表皮和莖上，直接刮取其粗蔗蠟；以蔗蠟為原料，通過(guò)乙醇熱回流、冷卻，粗蔗蠟的各成分被冷卻析出，去除機(jī)械雜質(zhì)、濾泥灰質(zhì)及膠質(zhì)等成分，蔗蠟產(chǎn)率在79.7%～83.7%之間。蔗蠟通過(guò)皂化水解、萃取、脫色精制等步驟制得精制多廿烷醇，得率在45.6%～50.3%之間。陳趕林等[10-11]從廣西上思糖廠甘蔗渣中提取4.20%～4.27%粗蠟，精蠟為2.38%左右；采用新鮮甘蔗表層蔗皮提取蔗蠟，得率為4.4%～4.6%。宋寧寧等[12]從濾泥中提取蔗蠟，以酯交換法從蔗蠟中提取高碳脂肪醇，其得率為16.75%～17.34%。侯宗福等以商品蔗蠟為原料，經(jīng)過(guò)乙醇精制長(zhǎng)鏈脂肪醇，其得率為24%。與甘蔗渣、濾泥、蔗皮及商品蔗蠟中提取高級(jí)脂肪醇相比，直接從甘蔗莖上刮取蔗蠟蔗，高級(jí)脂肪醇得率大大提高且操作簡(jiǎn)單，所需設(shè)備和流程不多。

采用GC分析方法對(duì)3種多廿烷醇中的高級(jí)脂肪醇的種類和含量進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明，3種多廿烷醇組分及含量類似，均以具有最強(qiáng)生理活性的正二十八烷醇為主要組分，其含量在61.58%～66.87%之間，同時(shí)含有16.97%～18.22%二十六烷醇和3.83%～4.09%三十烷醇，各成分含量顯著高于從蔗皮、蔗渣或?yàn)V泥中提取的各成分含量。

從甘蔗表皮和莖上，直接刮取其粗蔗蠟分離提取多廿烷醇，樣品純度高，提取工藝簡(jiǎn)單，這為多廿烷醇應(yīng)用到藥品及保健品等高端領(lǐng)域提供很好借鑒，也為甘蔗產(chǎn)業(yè)鏈的延長(zhǎng)和高值化提供有益參考。