葉碧峰 王曉光 梅建華 葉靈 倪曉媚 曾永 陳秀英

1麗水市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)檢測(cè)所，浙江麗水323000；2青田縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，浙江麗水323900

冠狀病毒是一大類病毒，在近20年中發(fā)生了3次由β-冠狀病毒引起的人畜共患病[1-3]。自2019年12月首次報(bào)道[4]的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）流行以來(lái)，直至現(xiàn)在仍在全球大流行。2020年至今，我國(guó)采取強(qiáng)有力的措施控制了新型冠狀病毒肺炎疫情，但在常態(tài)化防控階段，國(guó)內(nèi)多地出現(xiàn)散發(fā)、聚集或多點(diǎn)散發(fā)聚集疫情，當(dāng)?shù)胤揽夭块T通過(guò)對(duì)SARS-CoV-2全基因組序列測(cè)定及分析，迅速確定病毒來(lái)源，為疫情防控策略的制定以及后續(xù)溯源提供了參考依據(jù)。浙江省麗水市青田縣于2020年12月23日在入院患者應(yīng)檢盡檢中發(fā)現(xiàn)1例SARS-CoV-2核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)病例，通過(guò)SARS-CoV-2全基因組序列測(cè)定及分析，迅速追蹤到毒株來(lái)源于歐洲，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

一、病例概況

患者，女，58歲，漢族，西班牙馬德里歸國(guó)華僑，于2020年10月30日乘坐飛機(jī)從西班牙出發(fā)，11月1日到達(dá)天津，海關(guān)檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性，當(dāng)日送當(dāng)?shù)蒯t(yī)院被診斷為普通型新型冠狀病毒肺炎病例，11月10日治愈出院。在天津隔離期滿，核酸檢測(cè)陰性后于11月27日從天津返回青田。12月23日18時(shí)，患者因糖尿病到青田縣中醫(yī)院入院檢查，接受SARS-CoV-2抗體和核酸檢測(cè)，抗體IgG陽(yáng)性，核酸陽(yáng)性，上報(bào)青田縣CDC。

二、樣本來(lái)源

青田縣CDC赴現(xiàn)場(chǎng)采樣，采集了該患者的咽拭子和深咳痰樣本于同一管中，SARS-CoV-2核酸復(fù)核陽(yáng)性，送麗水市CDC進(jìn)行SARS-CoV-2全基因組序列測(cè)定。

三、核酸提取與定量

使用達(dá)安基因手工提取試劑盒提取患者咽拭子和深咳痰混合樣本中的總RNA，提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，50μL Elution液收集總RNA。采用SARS-CoV-2熒光定量試劑盒（上海明德生物科技有限公司）定量檢測(cè)SARS-CoV-2兩個(gè)基因靶標(biāo)（ORF1ab和N），并依據(jù)熒光強(qiáng)度與核酸濃度推算樣本中RNA的含量，檢測(cè)Ct值為26。

四、全基因組序列測(cè)定

利用Ion GeneStudio S5平臺(tái)對(duì)樣本開(kāi)展基因測(cè)序。使用Invitrogen試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)引物預(yù)擴(kuò)增，基因組DNA長(zhǎng)擴(kuò)增子構(gòu)建文庫(kù)：片段化、末端修復(fù)、接頭連接及純化、缺口修復(fù)片段篩選擴(kuò)增、文庫(kù)質(zhì)控Real-time PCR定量。使用CHEF全自動(dòng)實(shí)現(xiàn)乳液PCR克隆擴(kuò)增、模板制備、ISP富集和Ion 530芯片上樣。芯片加載到Ion S5測(cè)序系統(tǒng)上機(jī)。實(shí)驗(yàn)操作方法按儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

五、全基因組數(shù)據(jù)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)運(yùn)行SARS-CoV-2 Analysis進(jìn)行基因組組裝，相對(duì)于參考基因組的覆蓋率在95%以上。序列命名為L(zhǎng)S-20201224-QT01。利用全球資源共享數(shù)據(jù)庫(kù)Nextclade Nextstrain分析全球各層面的數(shù)據(jù)，用Nextclade工具將本地全基因序列與參考序列進(jìn)行比較，查看SARS-CoV-2的變異和進(jìn)化樹(shù)。應(yīng)用MEGA X軟件尋找最佳核苷酸替代模型，N-J（Neighbor joint）法構(gòu)建全基因組進(jìn)化樹(shù)，使用核苷酸突變來(lái)定義進(jìn)化支，通過(guò)先前構(gòu)建的Nextstrain樹(shù)找到進(jìn)化支的突變，以獲得COVID-19交互式傳播報(bào)告。

結(jié) 果

一、全基因突變分析

LS-20201224-QT01序列全長(zhǎng)29 815 bp，與武漢參考株（MN908947）序列相比，存在13個(gè)核苷酸突變及一段19 bp長(zhǎng)度的缺失，位于6 353～6 371區(qū)域，屬于Orf1ab段。這13個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)沒(méi)有聚集性，相對(duì)均勻地分布整個(gè)基因組，分別為241T、445C、3037T、5170T、6286T、11132T、14408T、21255C、22227T、23403G、26801G、28932T和29645T，多數(shù)是近期產(chǎn)生的，相比發(fā)生在宿主內(nèi)的在0～51、中位數(shù)為4變異數(shù)量，其進(jìn)化速率較高。

該序列包含了D614G突變，除D614位點(diǎn)外，不含有最近南非和英國(guó)報(bào)道的新型變異毒株的氨基酸關(guān)鍵性突變位點(diǎn)N501Y和69-70del。輸入序列9個(gè)核苷酸突變引起的氨基酸變異見(jiàn)表1。

表1 青田輸入性新型冠狀病毒肺炎病例全基因組序列LS-20201224-QT01的氨基酸變異情況

二、全基因同源性分析

青田SARS-CoV-2全基因組序列LS-20201224-QT01與西班牙馬德里66歲男性患者h(yuǎn)CoV-19/Spain/MD-IBV-99008729/2020的同源性高達(dá)99.8%，和國(guó)內(nèi)武漢hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019參考序列的同源性為99.3%，與中科院武漢病毒所在云南蝙蝠糞便中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒bat/Yunnan/RaTG13/2013同源性為96.3%，與SARS冠狀病毒Tor2的差異比較大，同源性僅為80.8%。

三、全基因進(jìn)化分析

在全球公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)Nextclade中檢索發(fā)現(xiàn)，青田輸入性病例SARS-CoV-2全基因組序列LS-20201224-QT01和武漢參考株序列hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019等我國(guó)國(guó)內(nèi)本土病例相關(guān)性較遠(yuǎn)，與多個(gè)西班牙收集的序列位于同一個(gè)進(jìn)化分支中（見(jiàn)圖1），特征符合L基因型歐洲進(jìn)化分支B.1.1特點(diǎn)，與英國(guó)突變株B.1.1.7分支[5]進(jìn)化較遠(yuǎn)。青田序列與BetaCoV/bat/Yunnan/RaTG13/2013形成了sarbecovirus屬的一個(gè)分支，而SARS-CoV和MERSCoV等病毒構(gòu)成了另一分支。

圖1 青田輸入性新型冠狀病毒肺炎病例全基因組序列LS-20201224-QT01與歐洲序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

討 論

青田是全國(guó)著名的僑鄉(xiāng)，隨著境外疫情不斷升級(jí)，境外輸入確診病例持續(xù)增加。本文病例在到達(dá)目的地按規(guī)定滿14 d解除集中隔離醫(yī)學(xué)觀察后，返回麗水，復(fù)查核酸呈陰性，26 d后復(fù)檢核酸呈陽(yáng)性。從該患者樣本中SARS-CoV-2的基因同源性比較結(jié)果分析，病毒株與西班牙毒株同源性最高，參考患者暴露史和行動(dòng)軌跡，考慮為西班牙輸入的復(fù)陽(yáng)病例。據(jù)報(bào)道，歐洲和南非等地病毒突變趨勢(shì)正在迅速崛起[5-7]。對(duì)本文患者病毒樣本全基因組序列測(cè)定結(jié)果顯示，序列包含了D614G突變，但不含有最近南非和英國(guó)報(bào)道的新型變異毒株的氨基酸關(guān)鍵性突變位點(diǎn)。D614可能在患者上呼吸道中具有更高的病毒載量，因此更容易傳播給他人，其傳播能力可能更強(qiáng)，但疫苗對(duì)這一毒株依然有保護(hù)效力[7]。

我國(guó)目前對(duì)SARS-CoV-2基因序列最為通用的分型方法是中國(guó)分型法（S/L主分支）和Pangolin分型法（A/B主分支），二者一般結(jié)合使用[8]。青田本次的復(fù)陽(yáng)病例經(jīng)過(guò)溯源，結(jié)合以上2種方法，與武漢參考株序列hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019等我國(guó)國(guó)內(nèi)本土病例序列相比，該毒株為L(zhǎng)型歐洲家系B.1.1分支，L型歐洲家系為目前歐美國(guó)家及其全球主要流行的家系，我國(guó)輸入性病例多為該家系。相比更古老的S亞型，L亞型更具侵略性、傳染力更強(qiáng)，今后需予以關(guān)注。

有報(bào)道稱復(fù)陽(yáng)病例多為合并基礎(chǔ)疾病的患者，尤其是合并糖尿病者最多[9]。本組病例患有糖尿病，是否提示合并糖尿病等基礎(chǔ)性疾病患者由于機(jī)體免疫力較低，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)病原體的清除延緩，有待進(jìn)一步觀察。鑒于合并基礎(chǔ)性疾病的患者在出院后發(fā)生復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象概率更大，建議出院前后反復(fù)多次進(jìn)行核酸檢測(cè)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)陽(yáng)患者。

綜上所述，該例輸入性復(fù)陽(yáng)病例SARS-CoV-2基因組序列屬于L基因型歐洲進(jìn)化分支B.1.1，為西班牙輸入的復(fù)陽(yáng)病例。本文從臨床樣本中分析SARSCoV-2的基因組，判定病毒的來(lái)源，為麗水市進(jìn)一步監(jiān)測(cè)病毒基因變異提供了一個(gè)可行的方案，為本地疫情的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防控策略的制定提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突