楊佳鵬, 龍貴云, 金道超, 戴仁懷, 吳麗紅, 周 操, 楊熙彬

(貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴陽作物有害生物科學(xué)觀測試驗(yàn)站, 貴陽 550025)

鞣化激素(Bursicon)是Fraenke和Hsiao(1962)在紅頭麗蠅Calliphoraerythrocephala上首次發(fā)現(xiàn)的由2個高度保守的α和β亞基組成的一類異源二聚體神經(jīng)肽。近年的研究相繼從直翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、半翅目以及膜翅目中鑒定出鞣化激素基因。鞣化激素基因的功能研究主要集中在昆蟲表皮的發(fā)育及其黑化硬化、翅的成熟和延展、預(yù)防性免疫、肌肉收縮以及卵子邊緣細(xì)胞的遷移等方面(朱斌等, 2014; 弓慧瓊等, 2018)。例如，利用雙雜交系統(tǒng)UAS-GAL4研究果蠅Drosophila鞣化激素基因的功能發(fā)現(xiàn)，鞣化激素基因突變后，果蠅的翅不能正常伸展(Luanetal., 2006; Anetal., 2008)；利用RNAi技術(shù)，干擾家蠶Bombyxmori鞣化激素基因Burs-α和Burs-β后均出現(xiàn)了翅褶皺的表型(Huangetal., 2007; Kobayashietal., 2012)。在家蠶翅發(fā)育的研究中，從翅芽的產(chǎn)生到發(fā)育成熟延展期間，Hippo, Dpp和Wnt等信號通路各自起著不同的調(diào)控作用(Zeccaetal., 1995; Neto-Silvaetal., 2009; Panetal., 2018)。例如敲除Hippo信號通路中的Approximated基因后，家蠶出現(xiàn)翅展畸形的現(xiàn)象，且翅發(fā)育相關(guān)基因Four-jointed(Fj)和Wingless(Wg)的表達(dá)顯著下調(diào)，表明了Hippo信號通路對家蠶的翅展不可或缺(Yuetal., 2018)。除此之外，在鞣化激素基因調(diào)控繁殖力的研究中，研究者通過注射鞣化激素基因重組蛋白，檢測到了鞣化激素可刺激黑虎蝦卵黃原蛋白(vitellogenin)基因Vg的表達(dá)(Sathapondechaetal., 2015)，推測了鞣化激素在節(jié)肢動物繁殖中的功能。

然而，在家蠶中鞣化激素與翅發(fā)育相關(guān)基因的聯(lián)系目前在現(xiàn)有的研究中未見報(bào)道，鞣化激素對其繁殖力是否有影響也未知。為明確鞣化激素與家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)系以及在家蠶繁殖力中的作用，本研究以家蠶為對象，通過體外合成鞣化激素2個亞基基因的dsRNA(dsBmBurs-α和dsBmBurs-β)，注射到家蠶蛹體內(nèi)，干擾BmBurs-α和BmBurs-β的表達(dá)，探明鞣化激素調(diào)控家蠶翅展的信號通路及其對家蠶繁殖力的影響，為系統(tǒng)地研究鞣化激素功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本研究所用的家蠶(兩廣2號)由江蘇省常州市新北區(qū)魏村蠶農(nóng)提供。將所得的白色家蠶卵塊置于氣候箱內(nèi)一次性方形塑料盒(15 cm×8 cm×5.5 cm)內(nèi)孵化，用新鮮桑葉飼養(yǎng)至結(jié)繭化蛹的蠶蛹。飼養(yǎng)條件：溫度25℃±1℃，相對濕度70%±10%，光周期16L∶8D。

1.2 dsRNA的合成

從NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中下載家蠶鞣化激素基因BmBurs-α(GenBank登錄號: NM_001098375.1)和BmBurs-β(GenBank登錄號: NM_001043824.1)序列，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并送上海生物工程有限公司合成。挑選家蠶幼蟲，參照HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, 美國)試劑盒說明書提取總RNA，并采用HiFiScript cDNA第1鏈合成試劑盒(CW Bio, 杭州)合成cDNA。以家蠶cDNA為模板，采用PCR體外擴(kuò)增家蠶BmBurs-α和BmBurs-β，以GFP 質(zhì)粒為模板，采用PCR體外擴(kuò)增GFP。反應(yīng)體系: 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 模板1 μL, 2×San Taq PCR Mix(With Blue Dye)10 μL, DEPC處理水10 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 55℃或65℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35個循環(huán); 72℃延伸5min。使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Sangon Biotech, 上海)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用NanoDrop 2000(Themo Fisher Scientific Inc, 美國)測定純化產(chǎn)物的濃度，參照試劑盒TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Themo Fisher Scientific Inc, 美國)合成dsRNA，檢測其合成的濃度，并將其于-80℃冰箱冷凍，待用。

表1 本研究所用的引物

1.3 RNAi實(shí)驗(yàn)

選取家蠶1日齡蛹，在蛹的胸部和腹部分界處用微量注射器(Sangon Biotech, 上海)分別注射dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β，每頭蛹注射10 μL(約20 ng)dsRNA；以注射等量的dsGFP作為對照(Wangetal., 2019)。每處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)為15頭蛹，其中10頭用于1.4節(jié)表型觀察及產(chǎn)卵量統(tǒng)計(jì)，5頭用于1.5節(jié)實(shí)驗(yàn)的取樣。注射完后置于氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，相對濕度為70%±10%，溫度為25℃±1℃，光周期為16L∶8D。

1.4 表型觀察及產(chǎn)卵量統(tǒng)計(jì)

對1.3節(jié)RNAi處理后羽化24 h的家蠶的表型進(jìn)行觀察，用佳能D500EOS 5D MACRO 100 mm鏡頭(Canon Inc., 日本)拍攝記錄家蠶表型的變化。對各注射處理后羽化出的30頭雌雄成蟲在氣候箱內(nèi)進(jìn)行交配后，雌蛾單頭飼養(yǎng)，每隔24 h定時觀察1次，對單頭雌蛾的產(chǎn)卵量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，直到雌成蟲死亡。每3頭雌蛾的產(chǎn)卵量為一個重復(fù)，每處理3個重復(fù)。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測家蠶基因表達(dá)

分別對1.3節(jié)RNAi注射處理后48, 72和96 h的單粒家蠶蛹以及每個處理組羽化后24 h雌雄成蟲各1頭進(jìn)行液氮速凍取樣，參照HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, 美國)提取總RNA。以提取的家蠶總RNA為模板，采用HiFiScript cDNA第1鏈合成試劑盒(CW Bio, 杭州)按照說明書操作步驟合成cDNA，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)研究報(bào)道，檢索家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因BmFt,BmDs,BmWg和BmFj以及產(chǎn)卵相關(guān)基因卵黃原蛋白基因BmVg和卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor)基因BmVgR(Linetal., 2013; Yuetal., 2018)，根據(jù)序列合成相應(yīng)的實(shí)時熒光定量PCR引物(表1)。以cDNA為模板，以家蠶BmActin3和BmGPDH為內(nèi)參基因(Huangetal., 2007; Yangetal., 2014)，參照Fast Start Essential DNA Green Maste(Roche, 瑞士)試劑盒進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系: FastStart Essential DNA Green Master 5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 1 μL, 加RNase-free Water 2 μL。震蕩混勻，短暫離心，放入實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行qPCR。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性30 s, 55℃退火并延伸30 s, 共40個循環(huán)。熔解曲線在65-95℃進(jìn)行。分別檢測RNAi處理48, 72和96 h后家蠶BmBurs-α,BmBurs-β,BmVg和BmVgR的表達(dá)動態(tài)以及羽化24 h家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因BmFt,BmDs,BmWg和BmFj的相對表達(dá)量。每處理和對照均測定3個樣品，每樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以測得的Cq值采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)檢測各基因的相對表達(dá)量，計(jì)算公式(Heetal., 2018)為：2-[(Cq 干擾組基因-Cq內(nèi)參基因)-(Cq對照組基因-Cq內(nèi)參基因)]，其中Cq內(nèi)參基因?yàn)槊總€樣品中2個內(nèi)參基因Cq值的平均值。采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用Duncan氏法做顯著性檢驗(yàn)，設(shè)置顯著水平為α=0.05，最后用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 干擾鞣化激素基因?qū)倚Q表型和產(chǎn)卵量的影響

與對照組相比，注射dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β后羽化24 h的家蠶的翅均呈現(xiàn)出卷曲、褶皺的畸形，不能正常伸展，翅畸形率分別為93.33%, 96.67%和96.43%(圖1)。

圖1 Bursicon 基因RNAi后家蠶羽化24 h成蟲的表型

如圖2所示，注射dsBmBurs-α, dsBmBurs-β以及dsBmBurs-α+dsBmBurs-β后，家蠶的平均單雌產(chǎn)卵量分別為312.67, 332.00和284.00粒，顯著低于對照組的406.00粒(P<0.05)。且當(dāng)dsBmBurs-α+dsBmBurs-β組合干擾時對家蠶的單雌產(chǎn)卵量的影響顯著高于單獨(dú)干擾其中任何一個基因。但注射dsBmBurs-α和注射dsBmBurs-β兩處理之間的單雌產(chǎn)卵量無顯著差異(P>0.05)。說明干擾Bursicon對家蠶的繁殖力有顯著的抑制作用，且組合干擾的效果優(yōu)于單個基因的干擾效果。

圖2 Bursicon基因RNAi后對家蠶成蟲單雌產(chǎn)卵量的影響

2.2 干擾鞣化激素基因后家蠶相關(guān)基因的表達(dá)

與對照相比，干擾Bursicon 基因48, 72和96 h后，BmBurs-α(圖3: A)和BmBurs-β(圖3: B)的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，干擾效率均在55.67%以上，最高達(dá)96.67%。RNAi處理后羽化24 h的家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因BmWg,BmFt,BmFj和BmDs在3個不同干擾組的表達(dá)均顯著低于對照組(P<0.05)(圖4)。BmFj,BmWg和BmDs的表達(dá)量在鞣化激素基因干擾后下調(diào)90%以上；注射dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β后BmFt的相對表達(dá)量分別下調(diào)34.33%, 94.67%和98.67%，可看出注射dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β對BmFt表達(dá)的影響顯著高于單獨(dú)注射dsBmBurs-α(P<0.05)。為探索Bursicon在繁殖上的功能，我們還檢測了在干擾Bursicon后BmVg和BmVgR的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，BmVg和BmVgR的相對表達(dá)量均顯著低于對照組(P<0.05)，且對BmVg的抑制效果達(dá)90%以上(圖5: A)；dsBmBurs-α和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β處理48 hBmVgR的相對表達(dá)顯著高于注射dsBmBurs-β的處理組(P<0.05)，dsBmBurs-α+dsBmBurs-β處理72 hBmVgR的相對表達(dá)量顯著高于dsBmBurs-α和dsBmBurs-β處理組(P<0.05)，dsBmBurs-α和dsBmBurs-β處理間無顯著差異(P>0.05)(圖5: B)。

圖3 家蠶Bursicon基因的RNAi干擾效率

圖4 Bursicon基因RNAi后對家蠶羽化24 h成蟲翅發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5 Bursicon基因RNAi后對家蠶蛹卵黃原蛋白基因(BmVg)(A)和卵黃原蛋白受體基因(BmVgR)(B)表達(dá)的影響

3 討論

Bursicon是一種異源二聚體神經(jīng)肽，在昆蟲表皮鞣化、翅展和免疫方面均承擔(dān)著重要的作用。本研究采用注射法，將體外合成的家蠶Bursicon基因的dsRNA(dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β)分別注射到家蠶1日齡蛹體內(nèi)以干擾Bursicon基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是單獨(dú)處理注射dsBmBurs-α或dsBmBurs-β，還是dsBmBurs-α+dsBmBurs-β組合干擾，家蠶體內(nèi)Bursicon-α和Bursicon-β的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)(圖3)，且在干擾Bursicon基因后，羽化的家蠶翅出現(xiàn)卷曲、褶皺的畸形，翅面不能進(jìn)行正常展平(圖1)，發(fā)育受到抑制，說明了，Bursicon對家蠶翅展具有不可或缺的作用。

在昆蟲翅的形成和發(fā)育的過程中，主要由Dpp信號通路、Hippo信號通路以及Wnt等信號通路通過共同作用、互相協(xié)調(diào)來決定昆蟲翅的最終發(fā)育形態(tài)(Irvine and Rauskolb, 2001; Wangetal., 2016)。尤其是Hippo信號通路在動物的組織發(fā)育過程中起著重要的作用(Zhangetal., 2009)。Zecca和Struhl(2010)的研究表明，在果蠅中Hippo通路上的形成素Wingless通過激發(fā)fat-dachsous信號和Yorkie的活性進(jìn)而促使翅的發(fā)育。在翅發(fā)育受到抑制時，這些基因的表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。在本研究中，干擾Bursicon基因表達(dá)后，家蠶翅面不能進(jìn)行正常展平，發(fā)育受到抑制，BmWg,BmFt,BmFj和BmDs的相對表達(dá)量顯著降低(圖4)。與此相似，在Yu等(2018)通過CRISPR/Cas9技術(shù)對Bmapp基因進(jìn)行特異性的基因敲除，使家蠶翅發(fā)育畸形后，檢測到了Hippo信號通路上BmWg和BmFj的表達(dá)受到顯著的抑制；在此之后，Yin等(2020)也證實(shí)在敲除BmSd家蠶翅變小后，BmWg的表達(dá)也顯著下調(diào)。因此，我們推測，Bursicon能夠調(diào)控Hippo信號通路上某些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響家蠶翅的伸展及發(fā)育，但這一過程是如何進(jìn)行的仍需進(jìn)一步的研究。

在昆蟲繁殖過程中，卵黃原蛋白及其受體在昆蟲卵母細(xì)胞成熟和繁殖過程中起主導(dǎo)作用(Goldsteinetal., 1979; Sappingtonetal., 1995)。如，在沉默煙粉虱Bemisiatabaci的卵黃原蛋白受體基因后，其雌蛾繁殖力顯著降低(Upadhyayetal., 2016)；同樣在干擾褐飛虱NilaparvatalugensVgR的表達(dá)后導(dǎo)致其卵巢停止了發(fā)育(Luetal., 2015)。Bursicon不僅能調(diào)控昆蟲翅發(fā)育，而且在繁殖方面可能也起著重要作用。例如，在果蠅中發(fā)現(xiàn)，Bursicon受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)能影響果蠅卵子邊界細(xì)胞的分離和遷移，進(jìn)而能影響卵孔的產(chǎn)生(Anllo and Schüpbach, 2016)；同時，Tsutsui等(2020)等通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Bursicon基因在日本對蝦Marsupenaeusjaponicus卵巢中高表達(dá)，更加印證了Bursicon在繁殖功能方面的潛力。在本研究中，干擾Bursicon基因可顯著抑制家蠶卵黃原蛋白及其受體基因(BmVg和BmVgR)的表達(dá)，相比對照組，干擾Bursicon基因后家蠶的產(chǎn)卵量(未包含產(chǎn)卵管中的殘留卵粒)顯著降低(圖2)，這可能是由于Vg和VgR的表達(dá)受限，卵母細(xì)胞的發(fā)育受阻，從而導(dǎo)致其產(chǎn)卵量減少。Sathapondecha等(2015)利用體外合成黑虎蝦Bursicon蛋白注入黑虎蝦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Bursicon重組蛋白能促使黑虎蝦卵黃原蛋白基因Vg高表達(dá)，刺激卵巢的發(fā)育。因此推測，家蠶Bursicon可能通過直接或者間接調(diào)節(jié)卵黃原蛋白及其受體基因的表達(dá)，進(jìn)而影響家蠶卵巢發(fā)育，來參與調(diào)控家蠶的繁殖。