張文豪, 龍?jiān)娀? 倪伊璐, 張佳慧, 李 勝,2, 李 康,2,*

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省昆蟲(chóng)發(fā)育生物與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆蟲(chóng)科學(xué)與技術(shù)研究所, 廣州 510631；2.梅州市華師昆蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣梅園研發(fā)中心, 廣東梅州 514779)

CRISPR/Cas9作為一種RNA引導(dǎo)的基因組靶向編輯技術(shù)，由導(dǎo)向RNA(single guide RNA, sgRNA)與帶有前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)區(qū)的靶標(biāo)基因DNA 片段匹配，指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)基因組序列進(jìn)行識(shí)別和切割，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行編輯(Brounsetal., 2008; Garneauetal., 2010)。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因敲除、基因修復(fù)和基因敲入等操作。在昆蟲(chóng)中，該技術(shù)首先在雙翅目物種果蠅Drosophila和埃及伊蚊Aedesaegypti(Gratzetal., 2013; Bassettetal., 2014; Basuetal., 2015; Halletal., 2015)，鱗翅目物種家蠶Bombyxmori、柑橘鳳蝶Papilioxuthus及金鳳蝶P.machaon(Wangetal., 2013; Lietal., 2015)中被報(bào)道，隨后陸續(xù)應(yīng)用于赤擬谷盜Triboliumcastaneum、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、斜紋夜蛾Spodopteralitura、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera和飛蝗Locustamigratoria等物種(Gillesetal., 2015; Huangetal., 2016; Li Yetal., 2016; Wangetal., 2016; Zhuetal., 2016; 童曉玲等, 2018)。

組蛋白甲基化修飾屬于表觀調(diào)控，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在多種信號(hào)通路包括細(xì)胞分裂、分化和凋亡等方面起到重要的調(diào)節(jié)作用(Taniguchi and Moore, 2014; Kangetal., 2017)。共價(jià)修飾例如甲基化、乙酰化和磷酸化等發(fā)生在組蛋白游離在外的N端(Lawrenceetal., 2016)。組蛋白是染色質(zhì)上核小體的主要成分，核小體是由2個(gè)H2A、2個(gè)H2B、2個(gè)H3和2個(gè)H4組蛋白組成的八聚體和147 bp環(huán)繞的DNA。組蛋白H3和H4的甲基化修飾研究較多，由保守的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶/去甲基化酶(histone methyltransferase/histone demethylase, HMT/HDMS)進(jìn)行修飾。H3K4(組蛋白H3氨基端4號(hào)位賴氨酸)，H3K36，H3R2(組蛋白H3氨基端2號(hào)位精氨酸)和H3R3甲基化修飾激活基因表達(dá)，H3K9，H3K27和H4K20甲基化修飾導(dǎo)致基因沉默(Yunetal., 2011)。

蛻皮激素20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)是一種類固醇激素，主導(dǎo)昆蟲(chóng)蛻皮、變態(tài)和生殖等生理過(guò)程(Riddifordetal., 2000; Yin and Thummel, 2005; Bondetal., 2010)。20E與其受體EcR-USP異源二聚體結(jié)合后形成配體-受體復(fù)合物20E-EcR-USP，獲得DNA結(jié)合活性，通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子上的EcRE結(jié)合，啟動(dòng)初級(jí)應(yīng)答基因(Br-C,E74,E75和E93等)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，隨后觸發(fā)自噬相關(guān)基因(Atg)以及天冬氨酸凋亡酶編碼基因Dronc和Drice及死亡激活因子reaper和hid的表達(dá)，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)變態(tài)過(guò)程中細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生(Spindleretal., 2009; 李康等, 2011; Li Ketal., 2016; 龍?jiān)娀鄣? 2019)。在果蠅中，已有報(bào)道組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Trr可以與EcR結(jié)合，并且對(duì)Br-C響應(yīng)20E的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行H3K4三甲基化，促進(jìn)20E對(duì)Br-C的轉(zhuǎn)錄激活(Sedkovetal., 2003)。組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Carmer與EcR結(jié)合后，促進(jìn)20E激活凋亡因子的表達(dá)，其功能喪失可以阻斷20E誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Cakourosetal., 2004)。相反地，另外一種組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶DART1作為EcR的共阻遏因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能，敲低其表達(dá)可以增強(qiáng)20E應(yīng)答元件EcRE的活性(Kimuraetal., 2008)。本研究將組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的sgRNA序列插入到牛津大學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的敲除載體pAc-sgRNA-Cas9骨架中，以修飾H3K4甲基化的Trr正調(diào)控20E對(duì)Br-C的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證敲除系統(tǒng)是否可以有效地在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster細(xì)胞中突變靶基因；此外，通過(guò)該敲除系統(tǒng)研究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶是否調(diào)控20E響應(yīng)元件EcRE的活性，對(duì)后續(xù)組蛋白甲基化修飾調(diào)控20E信號(hào)傳導(dǎo)的研究提供理論基礎(chǔ)。

體育游戲教學(xué)法作為一種新穎的教學(xué)方法，對(duì)學(xué)生的興趣產(chǎn)生了極大的影響，它能夠有效地將老師和學(xué)生結(jié)合在一起，保證學(xué)生始終都能以最積極的狀態(tài)來(lái)接受每一項(xiàng)教學(xué)內(nèi)容。教師作為游戲教學(xué)法的組織者和實(shí)施者，要積極的引導(dǎo)學(xué)生適應(yīng)這種教學(xué)方法，盡量做到根據(jù)每個(gè)學(xué)生的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)適合的體育游戲活動(dòng)，充分發(fā)揮學(xué)生的主觀能動(dòng)性，在促進(jìn)學(xué)生增強(qiáng)身體素質(zhì)的同時(shí)也要注重學(xué)生德智體全面發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)胞與試劑

黑腹果蠅Kc細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，利用添加5%澳洲胎牛血清(Gibco, 美國(guó))的施耐德培養(yǎng)基(Gibco, 美國(guó))于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(Heetal., 2014)。

pAc-sgRNA-Cas9敲除骨架載體訂購(gòu)于addgene(https:∥www.addgene.org/)，為牛津大學(xué)Liu實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(Bassett and Liu, 2014)，用于構(gòu)建黑腹果蠅組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的敲除載體。帶有連續(xù)4個(gè)拷貝20E應(yīng)答元件EcRE序列的熒光素酶載體PGL3-4×EcRE為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建(Guoetal., 2012)，PGL4-Rluc作為內(nèi)參載體，用于細(xì)胞中雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。pAc-sgRNA-Cas9載體帶有Ac5啟動(dòng)子表達(dá)的Cas9蛋白，同時(shí)反向插入dU6-2啟動(dòng)子表達(dá)的sgRNA序列。為了方便插入目的基因的靶向序列，兩段反向的BspQI識(shí)別位點(diǎn)CTTCTCG設(shè)計(jì)在dU6-2啟動(dòng)子和sgRNA序列之間，通過(guò)BspQI酶切之后，形成帶有dU6-2啟動(dòng)子-AAG和sgRNA-GTT粘性末端的線性質(zhì)粒。在該實(shí)驗(yàn)室提供的果蠅全基因sgRNA庫(kù)(Bassettetal., 2014)中查詢目的基因20 nt(N20)的靶向序列，合成帶有粘性末端的-TTCGN20-引物和N20反向互補(bǔ)-CN20CAA引物，通過(guò)退火形成目的基因的雙鏈靶向DNA序列，隨后利用T4 DNA連接酶與BspQI酶切線性化的pAc-sgRNA-Cas9載體連接，最終獲得目的基因的敲除載體(圖1)。選取發(fā)生甲基化修飾較多的H3K4和H3K9位點(diǎn)的5個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因[trr,Mes-4,ash1,Su(var)3-9和egg]作為研究對(duì)象，將每個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因和gfp的sgRNA靶向序列(表1)按照上述方法構(gòu)建到pAc-sgRNA-Cas9載體骨架中，獲得pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒，進(jìn)行果蠅Kc細(xì)胞中的敲除實(shí)驗(yàn)。

1.2 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及其修飾位點(diǎn)查詢

果蠅組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及其催化組蛋白H3/H4的氨基位點(diǎn)均從Flybase網(wǎng)站(http:∥flybase.org/)查詢并分析。

此次新研究為腦損傷治療方案提供了一種新的思路：在康復(fù)治療時(shí)，應(yīng)該考慮對(duì)大腦進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇碳?，而不是單純讓患者靜養(yǎng)。

1.3 載體構(gòu)建

主要試劑: 蛻皮激素(純優(yōu)生物, 上海)，5-脫氧-5-甲基胞苷(5-deoxy-5-methylthioadenosine, MTA)(MCE, 美國(guó))，BspQI限制性內(nèi)切酶(Thermo, 美國(guó))，T4 DNA連接酶(TaKaRa, 大連)，TaqTM酶(TaKaRa, 大連)，pMDTM18-T克隆試劑盒(TaKaRa, 大連)，去內(nèi)毒素質(zhì)粒和基因組抽提試劑盒(Promega, 美國(guó))，Effectene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen, 美國(guó))，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Dual-Luciferase Report Assay System)(Promega, 美國(guó))，Trizol(Invitrogen, 美國(guó))，M-MLV(RNase H-)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 大連)，SYBR-Green Mix(Bio-Rad, 美國(guó))，化學(xué)發(fā)光 HRP 底物(Millipore, 美國(guó))。

結(jié)果如圖2所示，帶有trr靶標(biāo)sgRNA序列的pAc-trr-sgRNA-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Kc細(xì)胞48 h后，抽提基因組進(jìn)行PCR，隨后利用TA克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染pAc-gfp-sgRNA-Cas9相比，轉(zhuǎn)染pAc-trr-sgRNA-Cas9的PAM區(qū)附近序列均有堿基突變，缺失和插入現(xiàn)象發(fā)生(圖2: A)；trr敲除后添加20E處理4 h，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)trr的敲除阻斷20E對(duì)Br-C的轉(zhuǎn)錄激活(圖2: B)，與在野生型Kc細(xì)胞中添加H3K4甲基化抑制劑MTA的結(jié)果(圖2: C)一致；Western blotting顯示，trr的敲除明顯降低細(xì)胞中H3K4三甲基化水平(圖2: D和E)。結(jié)果表明，該敲除系統(tǒng)可以有效地對(duì)靶基因進(jìn)行突變，用于后續(xù)在黑腹果蠅細(xì)胞中對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的喪失功能鑒定。

圖1 pAc-sgRNA-Cas9載體示意圖和靶基因sgRNA構(gòu)建策略(改自Bassett and Liu, 2014)

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提1.3節(jié)構(gòu)建的質(zhì)粒載體。黑腹果蠅Kc細(xì)胞提前24 h鋪板，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且鋪滿培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Kc細(xì)胞。

1.5 編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的基因突變驗(yàn)證

為了篩選和檢測(cè)參與20E信號(hào)傳導(dǎo)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，以20E應(yīng)答DNA元件EcRE驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性作為篩選標(biāo)志，分別將pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒與PGL3-4×EcRE和PGL4-Rluc內(nèi)參載體共轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Kc細(xì)胞，44 h后添加20E(2 μmol/L)處理4 h，添加0.1%(體積比例)的DMSO作為對(duì)照，DMOS和20E處理各3個(gè)重復(fù)，參照Dual-Luciferase Report Assay System試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定EcRE的熒光素酶活性，以F-luc(熒光素酶活性)/R-luc(海腎素酶活性)的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。

表1 引物信息

1.6 qRT-PCR檢測(cè)Br-C的轉(zhuǎn)錄水平

為了檢測(cè)pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒載體對(duì)靶基因突變的有效性，我們選擇已經(jīng)報(bào)道的甲基轉(zhuǎn)移酶Trr通過(guò)H3K4三甲基化修飾促進(jìn)20E誘導(dǎo)初級(jí)應(yīng)答基因Br-C的轉(zhuǎn)錄表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)該敲除系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。1.4節(jié)黑腹果蠅Kc細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAc-gfp/trr-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒44 h后，添加20E(2 μmol/L)處理gfp和trr敲除的Kc細(xì)胞4 h，添加DMSO作為對(duì)照，DMSO和20E處理各3個(gè)重復(fù)；未轉(zhuǎn)染pAc-gfp/trr-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒的野生型黑腹果蠅Kc細(xì)胞添加H3K4甲基化酶抑制劑MTA(1 mmol/L)或/和20E(2 μmol/L)處理12 h，0.1%(體積比例)的DMSO作為對(duì)照，DMSO, MTA或/和20E處理各3個(gè)重復(fù)；隨后收集相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒和藥物處理后的細(xì)胞樣品?？俁NA提取、反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第1鏈、qRT-PCR反應(yīng)體系和條件參已報(bào)道的方法(龍?jiān)娀鄣? 2019)。以果蠅rp49作為內(nèi)參基因，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物如表1所示。

1.7 Western blot檢測(cè)組蛋白甲基化水平

RIPA蛋白裂解液(碧云天, 上海)裂解1.4節(jié)轉(zhuǎn)染pAc-gfp/trr/Mes-4-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒48 h后的黑腹果蠅Kc細(xì)胞樣品，每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個(gè)重復(fù)，抽提細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(碧云天, 上海)測(cè)定蛋白濃度，Trr可以修飾H3K4三甲基化和Mes-4可以修飾H3K36單/二甲基化(表2)，利用H3K4三甲基化抗體(ABclonal, 武漢)檢測(cè)敲除trr后Kc細(xì)胞中的H3K4三甲基化水平，利用H3K36單/二甲基化抗體(ABclonal, 武漢)檢測(cè)敲除Mes-4后Kc細(xì)胞中的H3K36單/二甲基化水平，從而檢測(cè)trr和Mes敲除的有效性。利用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

筆者隨機(jī)選取了11所博士授予單位，對(duì)其研究生院學(xué)位管理部門(mén)進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查方式為電話或網(wǎng)絡(luò)通訊工具聯(lián)系，調(diào)查內(nèi)容主要為來(lái)華留學(xué)生博士論文撰寫(xiě)區(qū)別于本國(guó)學(xué)生的特別規(guī)定。

1.8 雙熒光素酶檢測(cè)EcRE活性

1.4節(jié)pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Kc細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，參照說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞基因組，在上述敲除基因的sgRNA序列上下游區(qū)域設(shè)計(jì)檢測(cè)引物(表1)，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為500 bp，利用TaqTM酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 μL): TaKaRa TaqTM酶(5 U/μL)0.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 基因組模板1 μL, 滅菌水37.5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 98℃變性10 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。擴(kuò)增后的DNA片段利用pMDTM18-T試劑盒進(jìn)行TA克隆并送廣州擎科公司測(cè)序(Li Ketal., 2016)，檢測(cè)靶基因突變位點(diǎn)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCT法計(jì)算qRT-PCR中基因的相對(duì)表達(dá)量；利用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算3組重復(fù)的誤差；利用單因素方差(one-way ANOVA)結(jié)合Duncan氏多重比較分析多組數(shù)據(jù)間的顯著性差異；利用t檢驗(yàn)計(jì)算兩組數(shù)據(jù)之間的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 果蠅組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及其修飾位點(diǎn)

將帶有敲除基因靶標(biāo)sgRNA序列的pAc-gfp/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Kc細(xì)胞48 h后，TA克隆測(cè)序結(jié)果顯示，4個(gè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因的PAM區(qū)附近均有堿基突變或缺失(圖3: A-D)。Western blotting顯示，Mes-4敲除后顯著減少H3K36的單/二甲基化水平(圖3: E, F)；隨后，敲除組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因并添加20E處理的細(xì)胞雙熒光素酶活性顯示，除修飾H3K4甲基化的trr敲除之外，Mes-4敲除也顯著降低20E誘導(dǎo)的EcRE熒光素酶活性，ash1敲除沒(méi)有影響；在修飾H3K9甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶中，egg敲除降低20E誘導(dǎo)的EcRE熒光素酶活性，而Su(var)3-9敲除沒(méi)有影響(圖3: G)。

表2 果蠅組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及其修飾位點(diǎn)

2.2 黑腹果蠅Kc細(xì)胞中敲除trr阻遏20E對(duì)Br-C的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)

5）在整體架構(gòu)方面。教育不單單是學(xué)校、教育學(xué)部所應(yīng)該關(guān)心的事情，更需要社會(huì)各個(gè)階層、各相關(guān)機(jī)構(gòu)共同努力奮戰(zhàn)，在共同體系、目標(biāo)下形成社會(huì)合力。針對(duì)一些創(chuàng)新課程，要啟發(fā)到什么程度，是以必修課還是選修課的方式呈現(xiàn)，都需要比較詳細(xì)的規(guī)定，建立具體的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 黑腹果蠅Kc細(xì)胞中trr敲除后對(duì)20E誘導(dǎo)的Br-C轉(zhuǎn)錄水平和H4K3三甲基化水平的影響

2.3 黑腹果蠅Kc細(xì)胞中敲除組蛋白甲基化酶基因?qū)?0E誘導(dǎo)EcRE活性的影響

通過(guò)Flybase網(wǎng)站查詢并總結(jié)所有果蠅組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及其修飾位點(diǎn)(表2)，結(jié)果顯示，果蠅組蛋白在H3的4號(hào)位、9號(hào)位、27號(hào)位、36號(hào)位和79號(hào)位，以及H4的20號(hào)位賴氨酸殘基均存在甲基化修飾，其中以H3上的4號(hào)位、9號(hào)位和36號(hào)位為主。H3和H4上精氨酸的甲基化修飾較少，只發(fā)生在H3的17號(hào)位(Art4)和H4的3號(hào)位(Art1)上。在所有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中，Trr, set1, G9a和Su(var)4-20不但修飾H3上賴氨酸的單甲基化，還可以進(jìn)行二/三甲基化修飾。此外，ash1和E(z)可以對(duì)H3多個(gè)位點(diǎn)上的賴氨酸殘基進(jìn)行甲基化修飾。

兩組比較，學(xué)生對(duì)OSCE模式滿意度較高，認(rèn)為OSCE模式更符合教學(xué)大綱，在評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、難易程度、時(shí)間安排均比傳統(tǒng)考核方式更合理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

圖3 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶突變檢測(cè)和20E誘導(dǎo)的EcRE雙熒光素酶活性測(cè)定

3 討論

本研究利用牛津大學(xué)Liu實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pAc-sgRNA-Cas9敲除載體骨架，在使用時(shí)僅將組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的靶向sgRNA序列插入兩個(gè)BspQI酶切位點(diǎn)中即可獲得目的基因的敲除載體，而且突變序列的測(cè)序鑒定和相應(yīng)組蛋白甲基化修飾抗體的Western blotting結(jié)果均驗(yàn)證了目的基因可以被有效地敲除和突變(圖2: A, D和E; 圖3: A-F)，該系統(tǒng)便于在果蠅細(xì)胞中研究基因的喪失性功能。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)室提供果蠅全基因靶標(biāo)序列庫(kù)，可以應(yīng)用于特定信號(hào)傳導(dǎo)、宿主和病原菌互作、離子運(yùn)輸?shù)妊芯浚ㄟ^(guò)結(jié)合藥物進(jìn)行大規(guī)模篩選獲得靶標(biāo)基因(Bassett and Liu, 2014; Viswanathaetal., 2018; 2019)。此外，后續(xù)可以基于該載體骨架進(jìn)行改造，將Ac5和dU6-2啟動(dòng)子替換成其他昆蟲(chóng)的特異啟動(dòng)子用以表達(dá)Cas9蛋白和靶基因sgRNA序列，應(yīng)用于不同昆蟲(chóng)細(xì)胞系的基因敲除和篩選研究。

王建國(guó)《扎實(shí)推進(jìn)習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義思想“三進(jìn)”的思考》指出，“扎實(shí)推進(jìn)習(xí)近平新思想‘三進(jìn)’是高校堅(jiān)持社會(huì)主義辦學(xué)方向的根本保證；是高校培養(yǎng)擔(dān)當(dāng)民族復(fù)興大任時(shí)代新人的時(shí)代需要；是促進(jìn)高等教育內(nèi)涵發(fā)展的必然要求?！盵1]吳愛(ài)萍《推進(jìn)習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義思想“三進(jìn)”的思考》指出，推進(jìn)習(xí)近平新思想“三進(jìn)”是用馬克思主義中國(guó)化最新理論成果武裝大學(xué)生頭腦的重大舉措；是加強(qiáng)和改進(jìn)高校思想政治理論課教育教學(xué)的迫切需要；是助力大學(xué)生成長(zhǎng)成才，培養(yǎng)有理想、有本領(lǐng)、有擔(dān)當(dāng)新時(shí)代青年的必然要求。

組蛋白甲基化修飾參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過(guò)改變?nèi)旧w構(gòu)象，暴露或者隱藏靶基因的DNA調(diào)控元件，達(dá)到激活或者抑制靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的功能(Yunetal., 2011)。EcRE是20E-EcR-USP復(fù)合物的DNA結(jié)合元件，已被廣泛應(yīng)用于20E信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的研究(Guoetal., 2012)。20E誘導(dǎo)初級(jí)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不但有組蛋白甲基化修飾參與調(diào)控，還有組蛋白乙?；刃揎?李康等, 2011)。本研究對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)除了已經(jīng)報(bào)道的Trr修飾的H3K4三甲基化正調(diào)控20E對(duì)Br-C的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Sedkovetal., 2003)(圖2: B和C)，同時(shí)檢測(cè)到Mes-4和egg通過(guò)影響EcRE的活性參與對(duì)20E信號(hào)的調(diào)控(圖3)。雖然雙熒光素酶的結(jié)果顯示敲除Mes-4和egg均降低EcRE的活性(圖3: G)，但H3K9發(fā)生甲基化一般是抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，推測(cè)egg對(duì)EcRE活性的影響是間接的；Mes-4修飾H3K36發(fā)生甲基化一般是激活基因表達(dá)，與20E通過(guò)應(yīng)答元件EcRE促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)相吻合，但Mes-4介導(dǎo)的二甲基化還是三甲基化調(diào)控EcRE的活性需要進(jìn)一步解析。

修飾H3K4甲基化的Trr蛋白通過(guò)N端的核受體互作序列LXXLL與20E受體EcR和USP結(jié)合，促進(jìn)Br-C的轉(zhuǎn)錄激活(Sedkovetal., 2003)；修飾H3K36甲基化的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶含有保守的核受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(suppressor of variegation 3-9 and enhancer of zeste and trithorax domains, SET domains)(Strahletal., 2002; Jeongetal., 2018)，推測(cè)Mes-4通過(guò)該SET結(jié)構(gòu)域與20E受體結(jié)合并促進(jìn)20E誘導(dǎo)的EcRE活性，從而激活下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，具體調(diào)控的靶標(biāo)基因和分子機(jī)制需要深入解析。

本研究采用牛津大學(xué)Liu實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pAc-sgRNA-Cas9敲除骨架載體和目的基因靶標(biāo)序列的構(gòu)建方法，利用該敲除系統(tǒng)在黑腹果蠅細(xì)胞中篩選和檢測(cè)參與調(diào)控20E信號(hào)傳導(dǎo)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，為今后利用細(xì)胞敲除系統(tǒng)探究組蛋白修飾在信號(hào)傳導(dǎo)中的分子調(diào)控機(jī)理奠定工作基礎(chǔ)。