肖 坤，郝婧薇，王 藝，曲寶成，傅松哲，劉 鷹

(1 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116023；2 設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連，116023;3 河北科技師范學(xué)院 海洋資源與環(huán)境學(xué)院，河北 秦皇島，066000)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(Recirculating aquaculture system，RAS)因其節(jié)水、高效、環(huán)保和產(chǎn)品安全被普遍認(rèn)為是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染、提高產(chǎn)品質(zhì)量、實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑[1-4]。然而由于養(yǎng)殖過程中飼料投喂和糞便產(chǎn)生等原因，養(yǎng)殖水體中存在相當(dāng)數(shù)量(3～25 mg/L)的總固體懸浮物(Total suspended solids，TSS)。固體懸浮物包括無機(jī)和有機(jī)兩種，其中有機(jī)固體懸浮物會導(dǎo)致氧的消耗、有機(jī)物腐敗和病原菌滋生等問題，而無機(jī)固體懸浮物極易堵塞養(yǎng)殖生物的鰓，吸附于懸浮物的大量病原微生物很容易造成宿主的鰓部感染，這些都大大增大了養(yǎng)殖生物的發(fā)病概率[5-8]。因此，如何降低循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的懸浮顆粒物質(zhì)量濃度，減少病害發(fā)生的潛在風(fēng)險，是實現(xiàn)循環(huán)水養(yǎng)殖新模式穩(wěn)定運行的關(guān)鍵[9]。

許多研究已表明過濾可以有效降低養(yǎng)殖水體致病菌含量。Huq等[10]于1996年使用家用紗麗材料制作的濾器對含有霍亂弧菌的水源進(jìn)行過濾試驗，結(jié)果表明過濾能夠去除水體中99 %的霍亂弧菌，可以有效地阻止霍亂的傳播。Fu等[11]將27種常見海洋細(xì)菌引入養(yǎng)殖鱸魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，之后通過20 μm的尼龍網(wǎng)或4層紗麗網(wǎng)對養(yǎng)殖水體進(jìn)行過濾，結(jié)果表明過濾可以去除養(yǎng)殖水體90 %的弧菌，過濾后養(yǎng)殖池鱸魚的死亡率顯著低于未過濾養(yǎng)殖池。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，微濾機(jī)在去除固體懸浮物上起著重要作用[12-14]。然而，微濾機(jī)在多大程度上能夠調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體中細(xì)菌種群組成的相關(guān)研究還未見報道。特別是長時間運行后，微濾機(jī)處理效果的相關(guān)研究較少。

采用FISH檢測和16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)識別和表征無微濾機(jī)的池A及微濾機(jī)過濾的池B養(yǎng)殖水體中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的變化，旨在為微濾機(jī)過濾對循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行探究，為循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)中病害的防控提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 循環(huán)水養(yǎng)殖試驗系統(tǒng)

以大連海洋大學(xué)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程研究中心實驗室內(nèi)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的循環(huán)水試驗系統(tǒng)進(jìn)行試驗，每套系統(tǒng)均由相同規(guī)格的養(yǎng)殖池、微濾機(jī)、蛋白分離器、生物處理系統(tǒng)、臭氧泵和紫外消毒裝置組成。養(yǎng)殖池規(guī)格為100 cm×80 cm×130 cm，兩套系統(tǒng)分別編號A和B，A系統(tǒng)無微濾機(jī)，表示為“池A”，而B系統(tǒng)安裝200目濾網(wǎng)直徑(約74 μm)的微濾機(jī)，表示為“池B”。在保持5%日補(bǔ)充新水量的情況下維持60 d。試驗用魚為紅鰭東方鲀幼魚(15.27 g/尾)，每個養(yǎng)殖池投放20尾，初始養(yǎng)殖密度2.55 kg/m3。系統(tǒng)的生物濾池均掛膜30 d后開始進(jìn)行試驗。養(yǎng)殖試驗中控制養(yǎng)殖水體DO 7～8 mg/L，pH 7.0～7.2，溫度(T)18～23 ℃，鹽度為30～32，水力停留時間(HRT)約為30 min。

1.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水樣采集與處理

自2018年6月29日開始養(yǎng)殖，在試驗第1天，第30天，第60天后分別于A和B養(yǎng)殖池水面以下0.1 m處采集水樣1.5 L，其中0.5 L用于水樣弧菌計數(shù)、異養(yǎng)細(xì)菌計數(shù)和FISH檢測，1 L用于養(yǎng)殖水體總基因組DNA的提取。所有樣品采集后立即在實驗室進(jìn)行以下處理：1)弧菌和異養(yǎng)細(xì)菌計數(shù)：取水樣2 mL后混勻備用。2)FISH檢測水樣制備：取100 mL養(yǎng)殖水體室溫下以甲醛(最終濃度，質(zhì)量/體積為2%)固定30 min后，于0.22 μm無菌醋酸纖維濾器過濾收集，雙蒸水沖洗過濾器收集樣品后于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?)提取總基因組DNA水樣制備：參照吳歡歡等[15]的方法，養(yǎng)殖水體以置有 0.22 μm 無菌醋酸纖維素酯膜的濾器進(jìn)行抽濾，之后將濾膜剪碎裝于無菌離心管中，以水樣微生物總 DNA 提取試劑盒(FOREGENE)對養(yǎng)殖水體細(xì)菌進(jìn)行基因組DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA提取質(zhì)量，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體弧菌和異養(yǎng)細(xì)菌計數(shù)

取養(yǎng)殖水體1 mL做10倍系列梯度稀釋液分別涂布于TCBS和LB平皿內(nèi)，每個稀釋梯度設(shè)置3個平行，于37 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計數(shù)[16]。

1.4 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌FISH檢測

篩選典型的r-策略菌群的弧菌屬(Vibrio)、k-策略菌群的紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)的紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)和玫瑰桿菌屬(Roseolacter)為檢測菌，利用Eilers等[17]設(shè)計的特異性寡核苷酸探針G-V(5’-AGGCCACAACCTCCAAGTAG-3’)和G-Rb(5’-GTCAGTATCGAGCCAGTGAG-3’)對養(yǎng)殖水體的r-策略菌群和k-策略菌群空間的分布變化進(jìn)行FISH檢測。

FISH檢測以Eilers等[17]方法按以下步驟進(jìn)行：1)將固定的水體樣本轉(zhuǎn)移至涂有聚四氟乙烯的顯微鏡載玻片上，通過空氣干燥進(jìn)行固定；2)將已干燥固定樣本依次以50%，80%和100%(wt/vol)乙醇進(jìn)行脫水和進(jìn)一步固定；3)脫水后將載玻片上的細(xì)胞與寡核苷酸探針G-V和G-Rb雜交；4)對雜交后的樣本進(jìn)行4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1 mg/mL)染色；5)將制備好的樣品置于顯微鏡下觀察。

1.5 16S rDNA文庫的構(gòu)建

提取養(yǎng)殖水體總基因組DNA，委托北京百邁克科技股份有限公司進(jìn)行16S rDNA V4區(qū)高通量測序及16S rDNA文庫的構(gòu)建?；?Illumina HiSeq 測序平臺，以雙末端測序(Paired-End)進(jìn)行小片段文庫的構(gòu)建，構(gòu)建后對文庫進(jìn)行測序，每個樣品重復(fù)2次。在對原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接后得到優(yōu)化序列。利用軟件QIIME(version 1.8.0)[18]中的UCLUST將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，進(jìn)而進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)的劃分，并根據(jù)OTU的序列組成獲得養(yǎng)殖水體樣本中細(xì)菌的物種分類。在OTU結(jié)果的基礎(chǔ)上對樣品進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得養(yǎng)殖水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)圖。Alpha多樣性分析研究97%以上相似度水平下的Ace、Chao1及Shannon指數(shù)，對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析。同時運用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)技術(shù)對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的差異性進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對養(yǎng)殖水體弧菌和細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行配對樣本T檢驗。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體弧菌和異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化

在養(yǎng)殖試驗周期內(nèi)，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運行正常，紅鰭東方鲀幼魚均未出現(xiàn)死亡且攝食與活動均較為正常。

養(yǎng)殖水體中弧菌總數(shù)如圖1所示，隨著時間的推移，養(yǎng)殖水體弧菌總數(shù)迅速升高，池A養(yǎng)殖水體弧菌總數(shù)均高于池B，尤其是第60天時，池A養(yǎng)殖水體弧菌總數(shù)顯著高于池B(P<0.05)。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體弧菌總數(shù)變化

養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)如圖2所示，隨著時間的推移，養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)亦迅速升高，

圖2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化

除試驗第1天外，池A養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)均高于池B，第60天時，池A養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)顯著高于池B(P<0.05)。

2.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的水體細(xì)菌空間分布變化

結(jié)果如圖3所示，養(yǎng)殖起始時，池A和池B養(yǎng)殖水體FISH檢測弧菌屬與紅細(xì)菌科信號的強(qiáng)度和數(shù)量相近且分布較為均勻。隨著時間的推移，檢測熒光信號強(qiáng)度及數(shù)量均逐步增加，表明檢測菌數(shù)量逐步增多。池A如圖3A所示，隨時間的推移，養(yǎng)殖水體中檢測弧菌屬熒光信號聚集成點狀，而檢測紅細(xì)菌科的熒光信號較均勻地分布于養(yǎng)殖水體中；池B如圖3B所示，隨時間的推移，養(yǎng)殖水體中檢測弧菌屬與紅細(xì)菌科熒光信號明顯增加的同時，依然較均勻地分布于養(yǎng)殖水體中。

圖3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌FISH檢測

2.3 16S rDNA擴(kuò)增測序

2.3.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌群落組成分析

對養(yǎng)殖水體各采樣點水體進(jìn)行16S rDNA V4擴(kuò)增測序，池A 3個采樣時間的水體分別標(biāo)記為1 A，30 A和60 A，池B 3個采樣時間的水體分別標(biāo)記為1 B、30 B和60 B。

樣品的覆蓋率(Good’s coverage)指數(shù)均達(dá)到99.9 %(表1)，說明本試驗測序深度足夠大，足以覆蓋樣品的大多數(shù)微生物，測序的數(shù)據(jù)量合理[19]。對OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋，結(jié)果顯示循環(huán)水系統(tǒng)水體中細(xì)菌主要分布于γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria)。其中，除1B養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌為Cobetia屬外，其他養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌均為弧菌屬、Erythrobacter屬和紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)。池A和池B養(yǎng)殖水體細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)存在一定差異，采集的養(yǎng)殖水體中，池A養(yǎng)殖水體中弧菌屬所占總細(xì)菌的比例隨時間的推移迅速升高，池B養(yǎng)殖水體中弧菌屬所占總細(xì)菌的比例在試驗第1天和第30天時均較小，在第60天時迅速升高。兩池相較而言，池A水體中的弧菌屬所占細(xì)菌總量的比例均顯著高于池B；除試驗第30天存在波動外，池A水體中具有較好調(diào)水作用的紅細(xì)菌科所占細(xì)菌總量的比例顯著低于池B(圖4)。

圖4 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成

2.3.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體的細(xì)菌群落多樣性分析

對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的Alpha多樣性(Alpha diversity)進(jìn)行分析，反映養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落物種豐度及多樣性。結(jié)果顯示：試驗第1天，池A養(yǎng)殖水體細(xì)菌種群Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯著低于池B，其他時間點池A和池B養(yǎng)殖水體Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)及Shannon指數(shù)均無明顯變化，即表明試驗第1天，池A養(yǎng)殖水體的細(xì)菌豐度和多樣性均高于池B，而其他時間池A與池B養(yǎng)殖水體的細(xì)菌豐度和多樣性無顯著變化(表1)。

表1 樣品的細(xì)菌群落多樣性

2.3.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌群落相似性分析

對池A和池B養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的測序結(jié)果進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)。PC1和PC2解釋了養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落 63.10%和 26.85%的信息，兩主成分之和大于89%，較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。分析結(jié)果顯示：除試驗第1天外，池A與池B距離較遠(yuǎn)，即表明除試驗第1天外，池A和池B養(yǎng)殖水體的細(xì)菌群落組成均存在較大差異(圖5)。

圖5 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌主成分分析

3 討論

3.1 微濾機(jī)過濾對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體弧菌和異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中細(xì)菌數(shù)量變動與系統(tǒng)中的有機(jī)質(zhì)、營養(yǎng)鹽狀況密切相關(guān)，而養(yǎng)殖水體中營養(yǎng)物質(zhì)分布并不均勻，微藻、飼料、糞便等固體懸浮物的營養(yǎng)物質(zhì)往往遠(yuǎn)高于周圍水體。營養(yǎng)物質(zhì)緩慢從固體懸浮物中釋放出來，致使海水中的營養(yǎng)物質(zhì)分布是作為熱點出現(xiàn)的[20]，部分細(xì)菌趨向并依附于高營養(yǎng)的區(qū)域[21-23]。因此，去除固體懸浮物在大幅降低養(yǎng)殖水體營養(yǎng)物質(zhì)含量的同時，將附著于固體懸浮物的細(xì)菌一并去除，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總數(shù)發(fā)生變化。本研究中，以池A與池B養(yǎng)殖水體進(jìn)行比較，池B弧菌總數(shù)均低于池A。同時，除試驗第1天外，池B異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)亦低于池A。

3.2微濾機(jī)過濾對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌空間分布的影響

Lauro等[21-23]研究表明水產(chǎn)養(yǎng)殖水體細(xì)菌可分為r-策略菌群和k-策略菌群，其中r-策略菌群多數(shù)具有較好適應(yīng)力和較強(qiáng)的運動性，在營養(yǎng)相對貧乏的養(yǎng)殖水體中趨向于營養(yǎng)豐富的固體懸浮物。k-策略菌群多數(shù)體積小，能夠最大限度地吸收單位水體的營養(yǎng)，同時由于其代謝可塑性差，無法利用固體懸浮物中組成復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)，因而在營養(yǎng)相對貧乏的養(yǎng)殖水體中對固體懸浮物不具有趨向性[21-23]。本試驗對典型r-策略菌群的弧菌屬和k-策略菌群的紅細(xì)菌科以FISH技術(shù)檢測池A與池B養(yǎng)殖水體細(xì)菌空間分布變化，結(jié)果顯示，r-策略菌群的弧菌屬對固體懸浮物具有趨向性，而r-策略菌群對固體懸浮物的趨向性可能導(dǎo)致了池A與池B養(yǎng)殖水體細(xì)菌空間分布的不同。

3.3 微濾機(jī)過濾對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在本試驗中，池A和池B養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)變化明顯，其中池B養(yǎng)殖水體弧菌屬所占細(xì)菌總量比例均顯著低于池A；除試驗第30天的紅細(xì)菌科所占細(xì)菌總量比例存在波動外，其他時間點的池B養(yǎng)殖水體的紅細(xì)菌科所占細(xì)菌總量比例顯著高于池A。水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大多數(shù)細(xì)菌性疾病是由弧菌屬等機(jī)會性病原菌引起的，這些病原菌在海洋環(huán)境中無處不在，且多數(shù)為r-策略菌群[20,24-25]。Lemire等[26]就曾于2015年報道牡蠣的致病弧菌屬對浮游動物和大顆粒物質(zhì)具有偏好性。紅細(xì)菌科屬于典型k-策略菌群，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中分布最廣的一類海洋細(xì)菌，沿岸地帶和極地分布尤其多[27]。該細(xì)菌能夠利用多種基質(zhì)作為碳源進(jìn)行混養(yǎng)的光合代謝反應(yīng)及CO2和氮的固定，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的碳、氮循環(huán)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[28-29]。本試驗的池B以微濾機(jī)過濾了養(yǎng)殖水體中的固體懸浮物，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分布較均勻，降低了養(yǎng)殖水體菌群中r-策略菌群的弧菌屬組成比例的同時，k-策略菌群的紅細(xì)菌科組成比例大幅升高，從而較大限度地降低循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)病害爆發(fā)的概率[26]。

3.4 微濾機(jī)的運行效率

微濾機(jī)運行時，大于濾網(wǎng)孔徑的顆粒物被攔截，截留的顆粒物隨時間的推移而增多，進(jìn)而導(dǎo)致濾膜堵塞，過濾效率降低，即使微濾機(jī)頂部設(shè)計了反沖洗裝置，但實際應(yīng)用效果有限[30-31]。本研究在試驗第60天時，池B養(yǎng)殖水體弧菌所占總細(xì)菌的比例大幅上升。同時，試驗第30天和第60天的池B養(yǎng)殖水體細(xì)菌多樣性無顯著性差異，由此判斷此時微濾機(jī)工作已接近飽和。因此，建議微濾機(jī)在運行60 d左右時需及時進(jìn)行濾膜的更換或清洗。未來研究還需要在不同工況下，比較微生物組成差異，從而更科學(xué)地對微濾機(jī)濾膜的更換時間進(jìn)行判斷。

4 結(jié)論

通過對微濾機(jī)過濾前后的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)性分析表明循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中安裝微濾機(jī)過濾裝置可以在去除固體懸浮物的同時有效降低潛在病原菌的數(shù)量。在養(yǎng)殖第60天時，池A和池B養(yǎng)殖水體弧菌和細(xì)菌數(shù)量均大幅增長，因此建議微濾機(jī)在運行60 d后需及時對濾膜進(jìn)行更換或清洗。本研究為微濾機(jī)的使用方法提供了一定的技術(shù)參考。

□