劉 丹，薛艾奇，李 雪，欒 天，汪海峰，張昕旸

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

酪氨酸激酶表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及其家族成員HER2是靶向癌癥治療的公認(rèn)靶點(diǎn)[1].自20世紀(jì)80年代以來，當(dāng)EGFR和HER2被提出作為潛在的抗癌靶點(diǎn)時(shí)，小分子激酶抑制劑已成為抑制EGFR和HER2激酶活性最具潛力的手段.迄今為止在美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)用于靶向癌癥治療的抑制劑中，拉帕替尼(lapatinib，A)和埃羅替尼(erlotinib，B)屬于4-苯氨基喹唑啉結(jié)構(gòu)(見圖1)，治療非小細(xì)胞肺癌或乳腺癌中發(fā)生的EGFR/HER2依賴性腫瘤[2-3].Pawar等[4]在4-苯氨基喹唑啉化合物的研究基礎(chǔ)上合成一系列6-取代-4-苯氨基喹啉衍生物(C，見圖1)，證明以喹啉為母核的化合物同樣具有較好的細(xì)胞毒活性；大量學(xué)者[5-8]在喹啉環(huán)的6位適當(dāng)引入吸電子基，提高了化合物對(duì)HER家族的多重抑制作用，進(jìn)而避免了耐藥性的產(chǎn)生.課題組曾設(shè)計(jì)并合成了一系列7-氟-4-苯氨基喹啉化合物[9]，部分化合物表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性.

圖1 酪氨酸激酶抑制劑Fig.1 Tyrosine kinase inhibitors

本文參考以上喹唑啉及喹啉化合物的構(gòu)效關(guān)系，以喹啉為母核，在喹啉的6位連接硝基，4位上引入芳氨基，共合成4個(gè)6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物(6a～6d)，并以SGC-7901、BEL-7402和A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，測(cè)定其體外抗腫瘤活性.合成路線及目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)如圖2所示.

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.2 Synthetic route of target compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型數(shù)字顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀,北京泰克儀器有限公司；ZF-7三用紫外分析儀，上海顧村電光儀器；Thermo-Finnigan LCQ型質(zhì)譜儀，美國熱電-菲尼根公司.

吉非替尼(gefitinib，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99 %)，齊魯(海南)制藥公司；RPMI1640 DMEM 培養(yǎng)基及胰酶，Gibeco公司；胎牛血清，北京鼎國生藥技術(shù)有限責(zé)任公司；溴化四氮唑鹽、蛋酶K和小牛血清蛋白，Sigma 公司；SGC-7901細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞和A549細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫；其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純.

1.2 合成

1.2.1 2-((4-硝基苯氨基)亞甲基)丙二酸二乙酯(1)的合成

取5.64 g(26.07 mmol)EMME與3.00 g(21.73 mmol)4-硝基苯胺置于三頸瓶中加入30 mL的正丁醇，回流攪拌反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束.將剩余物中加入無水乙醇，冷卻結(jié)晶，過濾，干燥后得5.82 g淡黃色針狀固體1，收率86.92 %，mp 141.91～142.23 ℃.

1.2.2 4-羥基-6-硝基喹啉-3-羧酸乙酯(2)的合成

將40 mL的聯(lián)苯-苯醚(質(zhì)量比為1∶3)加入100 mL的三頸瓶中，磁力攪拌下加熱至250 ℃，將2.00 g(6.51 mmol)化合物1分批并緩慢加入聯(lián)苯-苯醚中，250 ℃下反應(yīng)1 h.冷卻至室溫，加入40 mL石油醚，析出固體.過濾，濾餅用石油醚洗滌，干燥得1.32 g白色固體2，收率76.63 %，mp 352.54～352.81 ℃.

1.2.3 4-羥基-6-硝基喹啉-3-乙酸(3)的合成

在100 mL三頸瓶中加入1.02 g(3.90 mmol)的化合物2與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %的氫氧化鈉溶液30 mL，攪拌下回流反應(yīng)4 h.冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)pH至1，析出白色固體，抽濾，濾餅用水洗至中性，干燥后得0.85 g白色固體3，收率92.72 %，mp 284.54～286.43 ℃.

1.2.4 4-羥基-6-硝基喹啉(4)的合成

三頸瓶中加入0.50 g(2.17 mmol)化合物3和50 mL聯(lián)苯-苯醚試劑，240～250 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，加入50 mL石油醚，析出固體.抽濾，濾餅用石油醚洗滌，得0.32 g黃色固體4，收率91.44 %，mp 323.73～325.24 ℃.

1.2.5 4-氯-6-硝基喹啉(5)的合成

將0.30 g(1.58 mmol)化合物4溶于5 mL 三氯氧磷中，滴加1滴N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后，于80 ℃下反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢傾倒在冰水中并不斷攪拌，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至3，抽濾，濾餅水洗至中性，得白色固體，硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯(體積比為5∶1)，得0.28 g白色固體5，收率85.42 %，mp 142.21～142.84 ℃(文獻(xiàn)值[8]mp 144～145 ℃).

1.2.6 6-硝基-4-(4′-硝基苯氨基)喹啉(6a)的合成

將100 mg(0.48 mmol)化合物5，73.12 mg(0.53 mmol)4-硝基苯胺，38.00 mg(0.48 mmol)吡啶溶于30 mL異丙醇中回流，反應(yīng)結(jié)束.減壓蒸除異丙醇，冷卻至室溫，加入10 mL乙醚、10 mL飽和NaHCO3溶液，室溫?cái)嚢?.5 h，抽濾，濾餅用水洗至中性，硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯(體積比為5∶1)，得117.10 mg黃色固體6a，收率78.53 %，mp 219.91～220.53 ℃，MS(ESI)，m/z:311.82{[M+H]+}.

1.2.7 6-硝基-4-(2′-氨基苯氨基)喹啉(6b)的合成

化合物6b是由化合物5與2-氨基苯胺所得，制備方法如同化合物6a.黃色固體，收率79.13 %，mp 234.32～235.71 ℃，MS(ESI)，m/z:281.73{[M+H]+}.

1.2.8 6-硝基-4-(2′，3′，4′-三氟苯氨基)喹啉(6c)的合成

化合物6c是由化合物5與2，3，4-三氟苯胺所得，制備方法如同化合物6a.黃色固體，收率82.64 %，mp 210.52～211.74 ℃，MS(ESI),m/z:320.71{[M+H]+}.

1.2.9 6-硝基-4-(吡啶-3-亞甲基苯氨基)喹啉(6d)的合成

化合物6d是由化合物5與3-氨甲基吡啶所得，制備方法如同化合物6a，但不加乙醚.黃色固體，收率81.52 %，mp 198.94～200.22 ℃，MS(ESI),m/z:281.14{[M+H]+}.

1.3 體外抗腫瘤活性篩選

采用MTT法檢測(cè)4個(gè)6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞BEL-7402和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的體外抗腫瘤活性，選用吉非替尼作為陽性對(duì)照[10-11].3種細(xì)胞株均培養(yǎng)于含有10 %(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中.用胰酶使細(xì)胞脫壁，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度種植在96孔板中，置于含5 %(體積分?jǐn)?shù))CO2的37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜.然后將不同質(zhì)量濃度(0.4 mg/L，1.2 mg/L，3.6 mg/L，11 mg/L，33 mg/L)的待測(cè)目標(biāo)化合物以每孔20 μL的量加到96孔板中，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在恒溫箱中孵育48 h.之后在每孔中加入新配置的MTT溶液，在37 ℃恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h.每孔加入100 μL的DMSO使甲瓚完全溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔光密度(OD)值，計(jì)算所測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率.IC50為48 h后抑制細(xì)胞數(shù)量為50 %的藥物濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在合成化合物1時(shí)，最初選用乙醇作為溶劑[12]，由于硝基有強(qiáng)吸電誘導(dǎo)效應(yīng)和共軛效應(yīng)，使得硝基苯胺的氨基N原子的親核能力降低，因此，選用沸點(diǎn)較高的正丁醇代替乙醇作為溶劑，回流反應(yīng)，升高溫度有利于反應(yīng)的進(jìn)行，與乙醇作溶劑相比反應(yīng)時(shí)間大大縮短，通過TLC監(jiān)測(cè)完全反應(yīng)只需6 h.

2.2 體外抗腫瘤活性

體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果見表1.由表1可知:化合物6a(喹啉環(huán)4位苯氨基上連接硝基)對(duì)SGC-7901和BEL-7402細(xì)胞無活性，但對(duì)A549有較強(qiáng)的抑制活性(IC50為9.32 μmol/L)，且活性優(yōu)于吉非替尼(IC50為 14.77 μmol/L)；化合物6b(喹啉環(huán)4位苯氨基上連接氨基)對(duì)3種細(xì)胞均無抗腫瘤活性；化合物6c(喹啉環(huán)4位苯氨基上連接3個(gè)氟原子)對(duì)BEL-7402和A549細(xì)胞無活性，對(duì)SGC-7901細(xì)胞有較好的抑制效果(IC50為15.04 μmol/L)，活性與于吉非替尼相當(dāng)(IC50為 14.08 μmol/L)；化合物6d(喹啉環(huán)4位為吡啶基)對(duì)SGC-7901和A549細(xì)胞均無活性，而對(duì)BEL-7402細(xì)胞有中等抑制作用(IC50為 49.77 μmol/L).

表1 目標(biāo)化合物對(duì)人體癌細(xì)胞的體外抗增殖活性Table 1 In vitro anti-proliferative activity of target compounds against human cancer cell lines

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)未見報(bào)道的6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物，測(cè)定了其對(duì)SGC-7901、BEL-7402和A549細(xì)胞的抗腫瘤活性.化合物6a對(duì)A549細(xì)胞的抑制效果最好，IC50為9.32 μmol/L，活性優(yōu)于陽性對(duì)照藥吉非替尼；化合物6c對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制效果較好，與吉非替尼活性相當(dāng)，IC50為15.04 μmol/L；6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物進(jìn)一步衍生化研究、抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系研究正在進(jìn)行中.