王 巖 于 璐 高建偉 林 巍 薄力影

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

大葉千斤拔[Flemingiamacrophylla(Willd.)O.Kuntze]又名千斤力、千金紅等[1]，為2015年版中國藥典收載的豆科(Leguminosae)千斤拔屬(Flemingia)植物的一種[2]，廣泛分布于中國熱帶和亞熱帶省區(qū)[3]。千斤拔根具有諸多的藥理作用，常被作為煲湯原料出現在兩廣地區(qū)百姓們日常的餐桌。研究表明，千斤拔屬植物中含有黃酮、有機酸和生物堿等多種化學成分[4-6]，其中黃酮類成分是大葉千斤拔主要成分，尤其以異戊二烯基黃酮含量最多[7]。黃酮類化合物具有廣泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、保肝、抗炎和降血脂等[8-9]。

對大葉千斤拔黃酮類化合物進行提取，是開發(fā)其黃酮類化合物的關鍵步驟。目前研究者[10-11]主要利用有機溶劑如甲醇或乙醇的水溶液進行提取。提取方式主要包括回流提取[12]、超聲波輔助提取[13-14]、微波輔助提取[15]和靜態(tài)提取[16]等。超聲波和微波提取利用不同頻率的波，可加速黃酮化合物在溶劑中溶解的速率，但不易實現規(guī)模化生產；靜態(tài)提取效率過低，耗時較長。相比較而言，回流提取工藝既可節(jié)省提取溶劑，同時又在加熱過程中提高了分子熱運動，減少提取時間。因此，試驗擬采用乙醇回流提取大葉千斤拔中的總黃酮，以總黃酮含量為評價指標，通過響應面試驗優(yōu)化提取工藝條件，并對總黃酮提取物的抗氧化能力進行評價，以期為大葉千斤拔黃酮化合物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、硫酸：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

DPPH：分析純，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

ABTS、氯化銅：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

抗壞血酸：分析純，天津市登峰化學試劑廠；

新亞銅試劑、TPTZ、氯化鐵：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

過硫酸鉀：分析純，上海薩恩化學技術有限公司；

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

鉬酸銨：分析純，西隴科學股份有限公司；

磷酸鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

試驗水：超純水；

大葉千斤拔：云南楚雄中藥材經銷站。

1.2 儀器設備

超聲波清洗器：DL-360E型，上海之信儀器有限公司；

電子分析天平：BSA124S型，賽多利斯有限公司；

紫外可見分光光度儀：752型，上海新茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取工藝流程

大葉千斤拔根洗凈→烘干(60 ℃)→粉碎→過篩(80目)→乙醇回流提取(70%乙醇，80 ℃)→旋轉蒸發(fā)→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存?zhèn)溆?/p>

1.3.2 總黃酮含量測定

(1)標準曲線繪制：以蘆丁為標準物質。分別稱取0.2 mg/mL 蘆丁標準物質配置的溶液，取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL標準蘆丁溶液，將其分別置于離心管(10 mL)中，再加入0.3 mL 5% NaNO2后搖勻并靜置6 min，再加入AlCl3(0.3 mL，10%)，靜置6 min，然后加入4.0 mL 10% NaOH，使用70%的乙醇定容至刻線處，靜置15 min，然后在510 nm處測定反應液的吸光值，以吸光值為縱坐標，標準溶液中蘆丁的質量濃度為橫坐標作標準曲線(見圖1)。

(2)樣品總黃酮含量測定：取0.5 mL樣品溶液于10 mL 離心管中，加入1 mL 5% NaNO2搖勻，靜置6 min 后加入1 mL 10% AlCl3，搖勻，靜置6 min后加入10 mL 10% NaOH，再用70%乙醇溶液定容到25 mL，搖勻后靜置15 min，然后在510 nm處測定反應液的吸光值，空白以乙醇代替提取液。根據蘆丁標準曲線的線性方程計算樣品溶液中的總黃酮質量濃度?？傸S酮含量以蘆丁當量表示(μg/mg)。

(1)

式中：

RE——蘆丁當量，μg/mg；

50——樣品溶液稀釋倍數；

C——樣品吸光值代入蘆丁標準曲線得到的蘆丁質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

(1)提取時間：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇體積分數70%、提取溫度40 ℃，考察提取時間(20，40，60，80 min)對總黃酮含量的影響。

(2)料液比：固定提取時間40 min、乙醇體積分數70%、提取溫度40 ℃，考察料液比[m大葉千斤拔∶V乙醇分別為1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)]對總黃酮含量的影響。

(3)乙醇體積分數：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、提取時間40 min、提取溫度40 ℃，考察乙醇體積分數(60%，70%，80%，90%，100%)對總黃酮含量的影響。

(4)提取溫度：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇體積分數70%、提取時間40 min，考察提取溫度(20，40，60，80 ℃)對總黃酮含量的影響。

1.3.4 響應面試驗優(yōu)化提取條件 根據單因素試驗結果確定響應面試驗的因素水平取值，采用Box-Behnken設計，以總黃酮含量為響應值優(yōu)化大葉千斤拔總黃酮的乙醇回流提取工藝條件。

1.3.5 抗氧化性能測定 將使自由基溶液的初始濃度降低50%的樣品質量濃度定義為IC50；而還原力測定和磷鉬法測定中，使吸光值達到0.500的樣品濃度定義為IC50[17]。

(1)總抗氧化能力：采用磷鉬法[17]。

(2)DPPH自由基清除能力：根據Kim等[18]的方法。

(3)ABTS+自由基清除能力：根據Amirouche等[19]的方法。

(4)銅離子還原能力：采用CuPRAC法[20]。

(5)鐵離子還原能力：采用FRAP法[21]。

1.3.6 數據分析與處理 所有試驗數據均平行測定3次，采用Design-Expert 8.0.6、Statistix 8、Graphpad Prism 7軟件分析所得數據。

2 結果與分析

2.1 大葉千斤拔總黃酮提取工藝優(yōu)化

根據單因素試驗結果確定的試驗因素水平見表1。

表1 自變量因素編碼及水平

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計，試驗設計與結果如表2所示。

對表2試驗數據進行多元回歸分析，得到響應值對自變量提取時間、料液比、乙醇體積分數、提取溫度的二次多項回歸模型方程：

表2 乙醇提取大葉千斤拔總黃酮優(yōu)化試驗設計與結果

(2)

表3 回歸模型方差分析?

由圖2可知，料液比不變，隨乙醇體積分數增加，總黃酮含量呈先升后降趨勢。根據相似相溶原理，當乙醇體積分數較低或過高時不利于黃酮類物質游離出來。當乙醇體積分數恒定，隨溶劑量的增加總黃酮含量先逐漸增加后趨于穩(wěn)定。這是由于原料中的黃酮類物質隨萃取劑的增多基本被完全提取，因此總黃酮含量增加趨勢逐漸變緩。

圖2 乙醇體積分數和料液比對總黃酮含量影響的等高線和響應曲面圖

由圖3可知，當乙醇體積分數恒定，隨溫度的升高總黃酮含量逐漸增加后下降。這可能是溫度達到了乙醇水溶液的沸點，部分溶液揮發(fā)成氣態(tài)降低了提取效果。

圖3 乙醇體積分數和提取溫度對總黃酮含量影響的等高線和響應曲面圖

利用Design-Expert 8.0.6軟件解模型方程(2)的逆矩陣，求得總黃酮含量的最大預測值為76.036 μg/mg，其對應的提取工藝組合為提取時間52.148 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6.027(g/mL)，乙醇體積分數70.4%，提取溫度63.56 ℃。為方便驗證，取各參數的近似值：提取時間52 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇體積分數70%，提取溫度60 ℃，經3次實驗驗證，得到總黃酮含量平均值為75.47 μg/mg，相對于預測值，相對誤差為0.74%，說明該回歸模型優(yōu)化的工藝組合是有效的。

2.2 大葉千斤拔粗提取物的抗氧化能力

以大葉千斤拔粗提物質量濃度的對數值為橫坐標，自由基剩余率為縱坐標，利用Graphpad Prism 7軟件繪制自由基清除能力的半數抑制濃度曲線圖，如圖4所示。以大葉千斤拔粗提物質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制金屬離子還原能力的擬合線性圖，如圖5所示。

由圖4可知，隨著提取物質量濃度的增加，DPPH自由基和ABTS+自由基清除率逐漸上升。由表4可知，大葉千斤拔黃酮提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基的半數抑制濃度(IC50)分別為0.212 3，0.044 9 mg/mL。大葉千斤拔乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力，但與維生素C的清除能力還有一定差距。

圖4 大葉千斤拔提取物清除自由基能力

由圖5可知，隨著提取物質量濃度的增加，還原銅離子和鐵離子的能力逐漸增強。由表4可知，大葉千斤拔黃酮提取物對銅離子和鐵離子的半數抑制濃度(IC50)分別為0.221 9，0.731 7 mg/mL，對總抗氧化能力的半數抑制濃度(IC50)為0.389 6 mg/mL。大葉千斤拔乙醇提取物對金屬離子的還原能力與維生素C的相當。

圖5 大葉千斤拔提取物金屬離子還原能力與總抗氧化能力

表4 維生素C和大葉千斤拔提取物的抗氧化能力

3 結論

試驗采用乙醇為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗設計方法對大葉千斤拔的總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳的提取工藝為提取時間52 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇體積分數70%，提取溫度60 ℃，該條件下提取物的總黃酮含量為75.47 μg/mg。對黃酮提取物進行抗氧化活性評價，結果表明大葉千斤拔乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力，但與維生素C的清除能力還有一定差距，而對金屬離子的還原能力與維生素C的相當。試驗結果揭示了大葉千斤拔黃酮類提取物具有較強的體外抗氧化作用，后續(xù)將進一步探究其抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性。