李 珂，付文君，李紅梅，于晶晶，王 浩

低度慢性炎癥是2型糠尿病(T2DM)重要的發(fā)病機制之一。腸道微生態(tài)紊亂在糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[1]。25羥維生素[D(25(OH)D3]可抑制炎癥因子表達，而乳酸菌的補充可通過調(diào)節(jié)腸道菌群增加循環(huán)中25(OH)D3水平[2-3]。膳食纖維菊粉(Inulin,INU)作為一種益生元，通過刺激腸道益生菌的定植，減少炎癥反應，具有改善胰島素抵抗、降低高血糖的作用[4]。本研究通過膳食纖維菊粉干預不同時期T2DM小鼠，觀察各組小鼠25(OH)D3變化與腸道菌群、炎癥因子的相關性，探討在不同時期T2DM中腸道菌群與25(OH)D3的相互關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：從北京大學醫(yī)學部購買40只4周齡瘦素受體突變雌性小鼠(db/db)為2型糖尿病模型，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學動物中心。小鼠25(OH)D3ELISA試劑盒購自上海卡邁舒生物科技有限公司。膳食纖維菊粉購自河北省承德市豐寧平安高科實業(yè)有限公司。流式細胞儀為美國BD Bioscience公司的FACS Celesta。本研究通過了寧夏醫(yī)科大學動物倫理委員會批準審核(2016-044)。

1.2 T2DM小鼠模型和給藥：在寧夏醫(yī)科大學動物中心將小鼠禁食不禁水6 h后按2 g/kg體重口服50%葡萄糖注射液，分別于0、30、60、120 min取小鼠尾靜脈血測量血糖值。根據(jù)以往研究標準[5]，設定空腹血糖<7.0 mmol/L或葡萄糖負荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L并<11.1 mmol/L為糖尿病前期組(PDM組，20只)，空腹血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病期組(DM組，20只)，再從PDM組和DM組分別隨機取出10只作為菊粉干預糖尿病前期組(INU/PDM組)和菊粉干預糖尿病期組(INU/DM組)。菊粉干預組每日每只按5%(wt/wt)連續(xù)菊粉灌胃6周；模型對照組每日給予等量的生理鹽水灌胃6周。

1.3 外周血漿制備：腹腔注射1%戊巴比妥鈉注射液麻醉小鼠。采靜脈血離心，取血漿備用。

1.3.1 外周血25(OH)D3濃度測定：制備細胞因子標準稀釋液，首先分別在待測樣品孔內(nèi)先后加入樣品稀釋液和待測樣品混勻并溫育，洗滌空白孔和待測樣品孔；其次，在每孔先后加入顯色液A和B以顯色，最后在每孔加入終止液終止上述反應。在寧夏醫(yī)科大學基礎學院實驗室測定吸光度值，并算出對應的樣品濃度。

1.3.2 外周血炎癥因子檢測：取先前制備的外周血，在實驗室根據(jù)美國BD Bioscience公司的小鼠Th1/Th2/Th17細胞因子CBA檢測試劑盒說明書使用FACS Celesta BD流式細胞儀檢測IL-6、IL-10及TNF-a。使用 FCAP Array 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 血漿脂多糖LPS水平檢測：取先前制備的血漿加入鱟變形細胞樣裂解試劑孵育后，加入生色底物；最后加入冰醋酸溶液終止反應，測定吸光度值并計算LPS含量。

1.4 通過16S rRNA 測序分析各組腸道菌群：菊粉干預 6 周后，從每組中隨機選擇5只小鼠至新鮮的滅菌籠。分別收集每只小鼠的新鮮糞便并提取DNA，通過 PCR 擴增 V3、V4 區(qū)，進一步回收純化 PCR產(chǎn)物，送公司建庫并上機測序，利用生物信息學從門、屬的水平上分析比較各組腸道菌群中發(fā)生變化的細菌。

2 結(jié)果

2.1 菊粉干預前后各組25(OH)D3水平的比較：與未干預PDM組及DM組相比，INU/PDM組及INU/DM組中25(OH)D3均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組小鼠菊粉干預前后25(OH)D3水平的比較

2.2 相關性分析：菊粉干預不同時期T2DM 小鼠能夠降低體內(nèi)LPS及促炎因子水平，改善糖脂代謝異常；其中在屬水平與未干預PDM組及DM組相比，菊粉干預INU/PDM組及INU/DM組增加了產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的擬桿菌相對豐度(P<0.05)，同時降低了反芻螺菌_6的豐度(P<0.05)。與未干預PDM組相比，菊粉干預INU/PDM組的黏螺菌相對豐度降低(P<0.05)；與未干預DM組相比，菊粉干預INU/DM組黏螺菌相對豐度變化則差異無統(tǒng)計學意義。

2.2.1 25(OH)D3與炎癥指標的相關性：25(OH)D3分別與白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-a 及LPS呈負相關性，與IL-10(D)呈正相關性，見表2。

表2 25(OH)D3與炎癥指標的相關性

2.2.2 25(OH)D3與腸道菌群的相關性：25(OH)D3與產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的擬桿菌相對豐度呈正相關性，與黏螺菌和反芻螺菌_6的相對豐度呈負相關性，見圖1-圖3。

圖1 25(OH)D3與擬桿菌相關分析 圖2 25(OH)D3與黏螺菌相關性分析 圖3 25(OH)D3與反芻螺菌-6相關性分析

3 討論

25(OH)D3是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式。由人體皮膚經(jīng)紫外線照射或從飲食中獲得維生素D，并在肝臟中經(jīng)羥基化作用轉(zhuǎn)化為25(OH)D3，其含量可反映維生素D的水平。近年來許多研究除了強調(diào)維生素D在調(diào)節(jié)鈣磷代謝、維持骨穩(wěn)態(tài)方面的潛在重要作用外，還包括維生素D受體在大量非骨骼細胞如胰腺細胞中的表達。臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與其受體相結(jié)合觸發(fā)抗炎反應，同時可通過抑制NF-κB信號通路減少IL-6及TNF-a等促炎因子的表達，從而起到保護胰島β細胞的作用[6-8]。因此維生素D在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用，而這種作用可能與維生素D對胰島細胞功能、胰島素敏感性及全身炎癥的影響有關[9]。

胰島素分泌相對缺乏與胰島素抵抗是T2DM的主要發(fā)病基礎，而維生素 D 是維持正常胰島素分泌所必需的物質(zhì)，可改善胰島素的分泌和敏感性，對糖尿病起到一定的防治作用[10]。國內(nèi)外流行病學研究顯示，糖尿病患者普遍存在維生素D偏低，且維生素D缺乏的人群更容易罹患糖尿病。維生素D的補充可增加胰島素敏感性，對T2DM預后起著積極作用[11]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的動態(tài)平衡在糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著顯著的作用[12]。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過腸道黏膜屏障對多種炎癥或代謝過程產(chǎn)生影響。腸道菌群組成的改變，伴隨著腸黏膜屏障破壞、通透性增加，革蘭氏陰性致病菌產(chǎn)生的LPS(lipopolysaccharide) 轉(zhuǎn)位入血，血液循環(huán)中LPS 濃度增加，并激活 Toll 樣受體 4 信號通路而誘發(fā)一些炎癥因子如IL-6、IL-17及TNF-α的釋放，從而引起胰島素抵抗、血糖異常，導致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。維生素D受體的表達能影響腸道菌群的組成及多樣性[13]。同時，腸道菌群能夠調(diào)節(jié)維生素D的代謝，包括增加25(OH)D3[14]。益生元的補充能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響骨的重塑，促進骨形成，并增加維生素D受體的表達和活性[2]。益生元在不被代謝的情況下亦對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。菊粉是一種重要的膳食纖維益生元，促進腸道有益菌的生長，在結(jié)腸中發(fā)酵生成短鏈脂肪酸(SCFAs，如醋酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽)，已被證明可有效治療T2DM[4]。正如我們先前的研究發(fā)現(xiàn)[6]，菊粉干預不同時期T2DM 小鼠可以通過促進短鏈脂肪酸SCFAs的擬桿菌的相對豐度來恢復腸道微生態(tài)失調(diào)。擬桿菌的相對豐度與 IL-6 和 TNF-α 呈負相關性，提示擬桿菌的增加可能增強菊粉的治療效果。同時，與未干預糖尿病前期組(PDM)相比，菊粉干預INU/PDM組的黏螺菌相對豐度降低(P<0.05)；與未干預DM組相比，菊粉干預INU/DM組黏螺菌相對豐度變化差異無統(tǒng)計學意義。菊粉干預INU/DM組中反芻螺菌_6的相對豐度顯著降低，并且上述兩種菌與 IL-6、TNF-α及 LPS 呈正相關性，進一步證明黏螺菌和反芻螺菌_6 可以促進炎癥形成，而菊粉干預能減輕其促炎效果。

本研究通過對膳食纖維菊粉干預不同時期T2DM小鼠的25(OH)D3水平及其與炎癥因子和腸道差異菌進行相關性分析，結(jié)果顯示菊粉干預INU/PDM組及DM組與未干預組相比，25(OH)D3水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，25(OH)D3與促炎因子IL-6、TNF-α及 LPS呈負相關性，與抗炎因子IL-10呈正相關性；并且25(OH)D3與產(chǎn)短鏈脂肪酸SCFAs的擬桿菌呈正相關性，與促炎黏螺菌和反芻螺菌_6呈負相關性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，膳食纖維菊粉的補充可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成改善不同時期尤其在糖尿病前期T2DM小鼠25(OH)D3水平；維生素D水平的升高能改善胰島素敏感性，減輕系統(tǒng)炎癥反應，有助于延緩T2DM的發(fā)生發(fā)展，對減少T2DM及其并發(fā)癥有一定的臨床意義。