羅明秀,馬海江,張 甜 ,田 嫁,李正正,陳靜宏,曹峻嶺

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)基質(zhì)崩解、軟骨細(xì)胞的明顯減少為主要特性，但也存在滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨硬化等特征[1]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球OA的發(fā)病率在過去的近30年里增長了近20倍，并呈現(xiàn)出一定的年齡和性別特點(diǎn)[2]。研究表明，OA患者軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)較正常人顯著減少，ECM減少可使細(xì)胞生存環(huán)境及生存信號喪失而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。多聚蛋白聚糖(AG)是分布在關(guān)節(jié)軟骨ECM中最主要的蛋白聚糖之一，它和膠原是構(gòu)成ECM的主要生物大分子，在維持ECM組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制方面起著很重要作用。AG含有大量的酸性基團(tuán)，尤其是SO42-可吸納大量的水分，以保證軟骨的黏彈性以及抗壓能力[4]。研究表明，正常關(guān)節(jié)軟骨中硫酸酯酶表達(dá)較低且局限于軟骨表層，而OA軟骨硫酸酯酶mRNA和蛋白水平升高，可能引起蛋白聚糖硫酸化修飾及生長因子活性改變，從而導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞活性異常和軟骨基質(zhì)降解[5]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號在軟骨的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡與修復(fù)中有關(guān)鍵性的作用[6-7]，在OA樣的關(guān)節(jié)退行性改變中都與TGF-β信號通路有關(guān)[8]。引起OA的因素有很多，但目前仍缺乏有效的干預(yù)措施來阻止或減緩OA的發(fā)展進(jìn)程。因此，本研究以C-28/I2人軟骨細(xì)胞系為研究對象，構(gòu)建TGF-β1慢病毒載體，觀察TGF-β1降低后軟骨蛋白聚糖硫酸化修飾相關(guān)酶表達(dá)的情況，旨在探討骨關(guān)節(jié)病的病因和可能的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:C-28/I2人軟骨細(xì)胞系由美國康乃爾大學(xué)Mary B.Goldrin 教授惠贈(zèng)。GV-248質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，胎牛血清(鼎國,北京)，胰酶(Gibco，美國)，DMEM-F12培養(yǎng)基(HyClone,美國)，引物(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，蛋白提取試劑盒(上海鼎國生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒(Thermo,美國)；TGF-β1兔多抗(GeneTex,美國)，PAPSS2兔多抗(Biossion,9030R,中國)，PAPST1單抗(Santa Cruz,517131,美國)，CHST15兔多抗(Abcam,229223,美國)，β-actin單抗(Santa Cruz,美國)，山羊抗兔IgG(CST,7074,美國)，山羊抗鼠IgG(CST,7076,美國)。

1.2 TGF-β慢病毒包裝:設(shè)計(jì)3個(gè)人源TGF-β1基因RNAi靶點(diǎn)，即：TGFβ1-RNAi(17674-2)、TGFβ1-RNAi(17676-1)和TGFβ1-RNAi(17677-1)，用克隆載體GV-248構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序鑒定篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，用目的質(zhì)粒載體GV-248、病毒包裝輔助質(zhì)粒載體Helper1.0和Helper1.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清液，加入病毒保存液，充分溶解后以10 000 r/min離心5 min,收集上清液，用熒光法對病毒滴度進(jìn)行檢測。

1.3 C-28/I2人軟骨細(xì)胞的培養(yǎng):從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不時(shí)晃動(dòng)使其盡快解凍。待細(xì)胞凍存物完全解凍后以1 000 r/min離心5 min，用75%酒精擦拭凍存管消毒后移至超凈工作臺(tái)。吸去凍存液上清液，加入1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3 mL完全培養(yǎng)基的24 cm2培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻后放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞生長情況，并更換一次新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖達(dá)80%左右時(shí)，加入1 mL專用胰酶消化液(0.05%胰酶+0.02%EDTA溶于500 mL D-Hanks’液中)于37 ℃消化8～10 min后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

1.4 C-28/I2細(xì)胞TGF-β1慢病毒感染:將處于對數(shù)生長期的C-28/I2人軟骨細(xì)胞用胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基(10%血清+1%雙抗)制成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，從中取出2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞量達(dá)到20%時(shí)再更換成1 mL新鮮培養(yǎng)基，按照感染MOI值80加入TGF-β1慢病毒和HiTransG P感染增強(qiáng)版進(jìn)行感染。感染后繼續(xù)培養(yǎng)16 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況并拍照。

1.5 Western-blot檢測慢病毒感染C-28/I2細(xì)胞后各指標(biāo)蛋白的表達(dá):病毒感染C-28/I2軟骨細(xì)胞72 h后，用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。然后加入1/5 體積的6×loading buffer混勻，100 ℃金屬浴煮10 min，短暫離心后于-80 ℃溫度下保存?zhèn)溆谩８鹘M蛋白樣品按50 μg等量上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 mA,20 min；分離膠120 mA,1 h)；電泳結(jié)束，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(4 ℃、300 mA恒流,150 min)。用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1 h，分別加入用封閉液稀釋的抗體，如：兔多抗TGF-β1(1∶2 000)、PAPSS2(1∶1 000)、CHST15(1∶500)和單抗PAPST1(1∶200)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜4次，每次8 min。用封閉液稀釋相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，TBST充分洗膜4次，每次8 min。ECL發(fā)光，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行灰度值測定。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1慢病毒包裝滴度檢測:TGF-β1 3個(gè)不同靶點(diǎn)慢病毒RNAi經(jīng)測序證實(shí)全部與目的基因序列相通，對其用293T細(xì)胞和GV-248質(zhì)粒載體包裝后用熒光法測定其滴度，3個(gè)不同靶點(diǎn)TGF-β1慢病毒在加病毒10 μl時(shí)熒光中GFP表達(dá)最強(qiáng)、1 μl時(shí)次之，而0.1 μl時(shí)最弱。根據(jù)此熒光法可測得3種TGF-β1慢病毒的病毒滴度，選取加1 μl時(shí)計(jì)算得到的病毒滴度為后續(xù)試驗(yàn)的用量。

2.2 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細(xì)胞熒光表達(dá):根據(jù)感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取KD1、KD2和KD3即LV-TGFβ1-RNAi(17674-2)、LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)和LV-TGFβ1-RNAi(17677-1)病毒用量，分別為40 μl、40 μl和53.3 μl對C-28/I2人軟骨細(xì)胞系進(jìn)行感染。感染72 h 后，3個(gè)不同靶點(diǎn)TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細(xì)胞的GFP熒光表達(dá)與對照組相比都達(dá)到了80%左右且細(xì)胞狀態(tài)良好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細(xì)胞后TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表達(dá):將3個(gè)不同靶點(diǎn)TGF-β1慢病毒感染C-28/I2人軟骨細(xì)胞后提取總蛋白進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，如圖1所示(目錄后)，相對于NC組，KD1、KD2和KD3 3組中TGF-β1的表達(dá)均明顯降低，其中KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)組TGF-β1的表達(dá)降低最為顯著(P<0.05)，故后續(xù)只選擇KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)慢病毒感染細(xì)胞組的蛋白進(jìn)行下游相關(guān)酶蛋白分子的檢測。相對于NC組，PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表達(dá)都有所降低，其中PAPSS2降低最顯著(P<0.05)，而CHST15的表達(dá)降低不明顯，見圖1(目錄后)。

3 討論

TGF-β是其超家族成員之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的合成等過程，尤其是在軟骨的形成、維持和修復(fù)過程中均發(fā)揮著重要的作用[9]。TGF-β在人類中有3種結(jié)構(gòu)相似的亞型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，各亞型之間核苷酸序列高度同源并被不同的基因所編碼，其受體有3種形式分別為TβRⅠ型、TβRⅡ型和 TβRⅢ型[10]。研發(fā)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)的失活促進(jìn)了終端軟骨細(xì)胞的分化[11]，而TβRⅡ顯著抑制的小鼠能夠引起OA樣的病理性肥大和骨贅增生等癥狀[12]。研究者在利用小牛關(guān)節(jié)軟骨原代細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠保護(hù)軟骨的機(jī)制可能與下游目標(biāo)分子PAPS 合成酶2(PAPSS2)有關(guān)，TGF-β能夠維持軟骨的生物化學(xué)和生物力學(xué)性能并能夠調(diào)節(jié)PAPSS2的表達(dá)和小鼠關(guān)節(jié)軟骨中糖胺聚糖的硫酸化水平[13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可能通過依賴p38和Smad的信號通路機(jī)制，并通過調(diào)控PAPSS2基因的表達(dá)能夠同時(shí)使得SOX9蛋白穩(wěn)定表達(dá)[14]。TGF-β/Smad信號通路參與早期軟骨細(xì)胞形成，并在維持軟骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用[15]。

PAPSS2、PAPS轉(zhuǎn)運(yùn)體1(PAPST1)和N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸-硫酸轉(zhuǎn)移酶[CHST15]是軟骨聚集蛋白聚糖AG硫酸化修飾過程中相關(guān)的3種酶蛋白因子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，這3種酶蛋白因子在大骨節(jié)病(KBD)兒童軟骨以及KBD可疑致病因素DON毒素誘導(dǎo)的C-28/I2人軟骨細(xì)胞中的表達(dá)比正常對照組均顯著降低[16-17]。KBD是一種區(qū)別于OA和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的慢性、地方性骨關(guān)節(jié)病[18]，其典型特征包括ECM調(diào)節(jié)紊亂，基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加，以致組織完整性受損[19]。早期研究發(fā)現(xiàn)KBD患者中糖胺聚糖硫酸化代謝異常，表現(xiàn)為KBD患者關(guān)節(jié)軟骨ECM中硫酸軟骨素糖胺聚糖的表達(dá)顯著降低。而在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細(xì)胞后，TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達(dá)均較正常組細(xì)胞減少，這表明TGF-β在軟骨細(xì)胞中有重要作用，且有可能通過調(diào)控下游PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達(dá)來對軟骨ECM的蛋白聚糖硫酸化修飾產(chǎn)生一定影響。

綜上所述，TGF-β對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)多聚蛋白聚糖AG硫酸化修飾相關(guān)酶PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，為OA等骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但具體的信號通路機(jī)制還有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。