趙麗華，李 強

（1 西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川西昌 615000；四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000）

ISSR（inter-simple sequence repeat）是一種DNA 分子標記技術，其原理和操作與SSR、RAPD 非常相似，但其產(chǎn)物多態(tài)性遠比SSR、RAPD、RFLP 更加豐富，可以提供更多的關于基因組的信息，且操作簡單、重復性好、多態(tài)性豐富、DNA 樣品用量少和成本低的特點。目前已應用于枇杷[4]、觀賞桃[5]、龍荔[6]等植物的遺傳多樣性研究、品種鑒定等研究中。但是ISSR-PCR 反應體系的質量往往受到DNA、引物、Tap DNA 聚合酶、Mg2+等的濃度影響[4-6]。本研究旨在對杜鵑屬植物ISSR-PCR反應體系進行優(yōu)化，以獲得良好的試驗結果，為進行杜鵑屬植物種質鑒定、遺傳多樣性研究、分子標記輔助育種等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以“毛葉杜鵑”為供試材料。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL 2000 購自TaKaRa 有限公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 儀器。Eppendorf Mastercycler Gradient PCR 儀、六一廠DYY-8B 型電泳儀、復日FR-200A 全自動紫外與可見分析裝置等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取及檢測。應用CTAB 法提取“毛葉杜鵑”葉片基因組DNA[6-7]，稀釋為100ng/μL 工作液，放入4℃冰箱里備用。

1.3.2 ISSR-PCR 體系優(yōu)化。以UBC811 為引物，對“毛葉杜鵑”葉片基因組DNA 進行PCR 擴增。對影響PCR反應的Taq DNA 聚合酶、Mg2+、引物、模板DNA 濃度進行正交試驗設計L9（34）（表1），按表1 編號加樣后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用滅菌后的ddH2O補足20μL。每個處理重復1 次。

表1 ISSR-PCR 反應體系正交試驗設計L9（34）

參照潘麗梅等[6,8-10]的設定擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性45s，退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產(chǎn)物，用紫外與可見分析裝置觀察并拍照記錄。根據(jù)電泳的正交試驗結果，對各處理進行綜合評定。

根據(jù)電泳的正交試驗結果，選出正交試驗結果中較佳PCR 體系組合，再在此體系基礎上進行UBC820引物單因素調整（表2），按表2 編號加樣后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用滅菌后的ddH2O 補足20μL。

表2 單因素調整表

1.3.3 ISSR-PCR 反應體系穩(wěn)定性檢測。根據(jù)正交試驗結果篩選出最佳體系，對5 個杜鵑屬植物種DNA 進行ISSR-PCR 擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產(chǎn)物，檢測ISSR-PCR 反應體系穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 ISSR 反應體系優(yōu)化

按表1 正交設計的9 個處理進行PCR 反應后，電泳結果如圖1 所示。圖1 顯示：在9 個處理中，擴增效果存在著明顯差異。經(jīng)綜合評定處理1、2、3 的擴增DNA 條帶數(shù)較多，但背景彌散較嚴重，其中處理2、3的擴增DNA 條帶數(shù)多于處理1，并且亮度較高。處理4、5、6、7、9 背景較彌散較嚴重，且DNA 條帶數(shù)較少。處理8 條帶數(shù)較少，且背景彌散。綜合擴增的DNA 條帶數(shù)及背景彌散程度，處理2、3 相對擴增效果較好。

圖1 正交設計試驗PCR 產(chǎn)物電泳圖

以處理2 為基礎，調整著引物濃度，電泳結果如圖2 所示。在9 個處理中，處理a、b 的DNA 條帶數(shù)較多，但背景彌散較嚴重；處理c、d、f、h 背景干凈但條帶數(shù)較少；處理i 沒有清晰的DNA 條帶，且背景彌散；處理e、g 的背景輕微彌散，DNA 條帶數(shù)較多且清晰，處理e的綜合效果優(yōu)于處理g。

圖2 單因素調整試驗PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 ISSR-PCR 反應體系穩(wěn)定性檢測

根據(jù)體系優(yōu)化試驗結果，用引物UBC 810 對5 個杜鵑種進行PCR 擴增，電泳結果顯示（圖3）：擴增譜帶清晰，背景彌散輕，多樣性豐富，表明所建立的杜鵑屬ISSR-PCR 反應體系穩(wěn)定可靠。

圖3 UBC 810 對部分杜鵑的PCR 擴增結果

3 討論與結論

ISSR-PCR 反應體系中 的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 等各因素都會影響PCR 產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而且不同物種的最佳ISSR-PCR 反應體系也不相同。因此，應先對ISSR-PCR 反應體系進行優(yōu)化，以保證試驗結果的可靠性[11-12]。Mg2+濃度不僅影響Taq DNA 聚合酶活性，還能影響引物與模板的結合效率、模板與PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度。引物濃度過低，則不能進行有效的擴增；引物濃度過高，則會引起錯配和非特異性擴增。Taq DNA 聚合酶濃度過高，反應特異性降低。模板DNA 濃度過高，則導致引物或dNTPs 過早耗盡，出現(xiàn)非特異性擴增，產(chǎn)生彌散；DNA 濃度過低，則反應產(chǎn)物減少，會使擴增的條帶變弱[13-14,16]。本研究采用正交試驗設計L9（34）進行DNA 模板、引物、Taq 酶、Mg2+不同濃度水平組合，試驗結果顯示：正交試驗設計L9（34）不同組合間，擴增效果存在著明顯差異（圖1），其中2、3反應體系綜合效果最好，但背景彌散仍較嚴重，而正交試驗設計L9（34）中引物濃度已為最低，在此基礎上對PCR 引物再進行單因素的調整，確定杜鵑屬植物ISSR-PCR 的20μL 最優(yōu)反應體系為：Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA 聚合酶1U、模板DNA 20ng、引物0.9μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、1×PCR buffer?？蔀镮SSR 技術對杜鵑屬植物進行遺傳分析以及輔助育種提供參考。