于曉光，喬 健，王 晨，王 輝

(秦皇島市九龍山醫(yī)院藥劑科，秦皇島 066000)

當(dāng)歸龍薈丸具有瀉火通便的功效，臨床主治肝膽火旺、心煩不寧、頭暈?zāi)垦！⒍Q耳聾、脅肋疼痛、脘腹脹痛和大便秘結(jié)等癥[1-4]，該藥由酒當(dāng)歸、龍膽、蘆薈、青黛、梔子、酒黃連、酒黃芩、鹽黃柏、酒大黃、木香和人工麝香11味藥材經(jīng)粉碎、配研、混合和干燥等工序加工制成[5]。方中黃芩有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效[6-9]，黃柏有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效[10-13]，龍膽有清熱燥濕、瀉肝膽火等功效[14-17]?，F(xiàn)階段隨著生活、工作壓力的不斷增大，以及熬夜等不良習(xí)慣的影響，患有肝膽火旺、心煩不寧的人群較多，當(dāng)歸龍薈丸屬中藥方劑，臨床使用較多。當(dāng)歸龍薈丸現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，不能較好地控制該品種的質(zhì)量。本文針對(duì)黃芩、黃柏和龍膽3味藥材[18-21]，采用RP-HPLC法檢測(cè)當(dāng)歸龍薈丸中黃芩苷、龍膽苦苷和鹽酸黃柏堿3種成分的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent HPLC 1260 infinity型高效液相色譜儀，配備G1311B型四元泵、G1229B型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和G1314型二極管陣列檢測(cè)器等(美國(guó)安捷倫儀器公司)；Waters Spherisorb ODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)沃特世儀器公司；AB 135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；KQ-300 VDB型雙頻超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct 8型純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博儀器公司)。

1.2試藥 當(dāng)歸龍薈丸(規(guī)格：6 g·袋-1，批號(hào)分別為：20190127、20191113、20191202)，北京同仁堂制藥有限公司。對(duì)照品：黃芩苷(批號(hào)110715-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.4%)，龍膽苦苷(批號(hào)110770-201918，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.1%)，鹽酸黃柏堿(批號(hào)111895-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.9%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇和乙腈均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；磷酸，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為自制純化水。

2 方法

2.1色譜條件 采用Waters Spherisorb ODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：32 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫。洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 精密稱取3種成分對(duì)照品，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成3種成分質(zhì)量濃度分別為194.20、57.24、94.90 μg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取3種單一對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.2.2供試品溶液 取當(dāng)歸龍薈丸2袋，研細(xì)，精密稱取2.0 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇35 mL，超聲處理30 min(超聲頻率60 kHz，功率200 W)，放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 按照當(dāng)歸龍薈丸藥材比例和加工方法分別制備缺龍膽、黃芩和黃柏的陰性樣品，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.4對(duì)照藥材溶液 按照當(dāng)歸龍薈丸藥材加工方法分別制備龍膽、黃芩和黃柏的對(duì)照藥材樣品，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制得對(duì)照藥材溶液。

2.2.5空白溶液 按照2.2.2項(xiàng)下方法制備不含供試品的空白溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果3種成分與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，混合對(duì)照品溶液與供試品溶液中3種成分色譜峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。見(jiàn)圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察 取2.2.1項(xiàng)下制備的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制備系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，收集色譜圖。以待測(cè)物響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回歸方程和線性范圍

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果3種成分精密度RSD值分別為0.92%、1.14%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取當(dāng)歸龍薈丸(批號(hào)20190127)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果3種成分重復(fù)性RSD值分別為1.83%、2.04%、1.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取當(dāng)歸龍薈丸(批號(hào)20190127)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下分別放置0、3、6、9、12、24 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果3種成分穩(wěn)定性RSD值分別為2.12%、1.25%、1.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6回收率實(shí)驗(yàn) 取當(dāng)歸龍薈丸(批號(hào)20190127)，倒出內(nèi)容物，置于研缽中研細(xì)，精密稱取1.0 g，置于25 mL量瓶中，平行稱取6份，分別加入3種成分單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，后續(xù)按照2.2.2項(xiàng)下方法處理，制得6份加樣供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，收集色譜圖，根據(jù)色譜圖峰面積計(jì)算待測(cè)成分的平均回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4樣品含量檢測(cè) 取3批當(dāng)歸龍薈丸，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，收集色譜圖，計(jì)算3份供試品中3種成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取3種成分對(duì)照品，加甲醇制備成質(zhì)量濃度均為10 μg·mL-1的波長(zhǎng)測(cè)試溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，設(shè)置二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖和光譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種成分的最大吸收波長(zhǎng)分別為271、280、283 nm，波長(zhǎng)相近，但由于龍膽苦苷的信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較低，因此選擇276 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的確定 實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相體系，檢測(cè)其對(duì)3種待測(cè)成分分離的影響。結(jié)果顯示，選擇甲醇-水體系時(shí)，鹽酸黃柏堿分析時(shí)間長(zhǎng)，色譜峰展寬、拖尾；選擇乙腈-水體系時(shí)，3種成分分離良好，且分析時(shí)間短，色譜峰峰形尖銳。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)水-2 mL·L-1磷酸和水-2 mL·L-1冰醋酸進(jìn)行了考察，對(duì)梯度洗脫中流動(dòng)相的比例進(jìn)行摸索，最終確定以乙腈-2 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相體系，按照2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)當(dāng)歸龍薈丸中3種成分的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形尖銳，待測(cè)成分均能達(dá)到有效分離，定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3提取方法的優(yōu)化 當(dāng)歸龍薈丸由11味藥材組成，基質(zhì)較為復(fù)雜，前處理方法的優(yōu)化對(duì)于提高分析效率和結(jié)果準(zhǔn)確性有重要影響。取當(dāng)歸龍薈丸，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，分別選擇甲醇、體積分?jǐn)?shù)分別為95%、85%、75%的甲醇作為提取溶劑時(shí)，考察對(duì)3種成分提取情況的影響，結(jié)果選擇甲醇作為提取溶劑時(shí)，提取效果最佳；再分別考察提取時(shí)間和超聲功率的影響，最終確定以甲醇作為提取溶劑，超聲頻率為60 kHz、功率為200 W，超聲處理30 min為最佳提取條件。

綜上所述，本研究建立了能同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸龍薈丸中的黃芩苷、龍膽苦苷和鹽酸黃柏堿含量的RP-HPLC法，結(jié)果表明，該方法適用于當(dāng)歸龍薈丸的質(zhì)量控制，可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。