陶 杰，張敬寒，徐 思，劉宇權(quán)，劉艷麗，張以芳，鄒豐才，柴 俊*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明650201；2. 墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南墨江654800；3. 墨江縣畜牧工作站，云南墨江654800）

禽支原體感染在世界上分布廣泛，雞群中感染水平較高，常見的有雞滑液囊支原體和雞毒支原體。近年來，雞滑液囊支原體發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]，是由雞滑液囊支原體（Mycoplasmasynoviae，MS）感染引起，以跗關(guān)節(jié)滲出性的滑液囊膜炎和腱鞘滑膜炎為特點(diǎn)的慢性或急性傳染病[2]。各品種雞均易感染，以雛雞為首。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在東歐、荷蘭、墨西哥、阿根廷均存在MS 感染[3-4]；美國(guó)商品蛋雞普遍感染[5]；西歐弗蘭德斯地區(qū)感染率達(dá)76.3%[6]。MS 一年四季均會(huì)發(fā)生，春、冬兩季比較常見，主要傳染源是病雞或存在隱性感染的雞[7]。MS 可以通過種雞蛋進(jìn)行垂直傳播，也通過飼養(yǎng)人員攜帶、飲用水污染等因素進(jìn)行直接或間接的水平傳播[8]。不同菌株的感染對(duì)雞致病性不盡相同[9]，能夠引起不同程度的亞臨床型上呼吸道感染、關(guān)節(jié)炎和傳染性滑膜炎，使雞的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、雞肉品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起雞免疫系統(tǒng)的抑制[10]。雞場(chǎng)一旦發(fā)生該病，很難根除，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來難以估量的損失?，F(xiàn)有云南昆明某雞場(chǎng)中的雞出現(xiàn)陸續(xù)癱瘓死亡，部分雞喜臥、站立不穩(wěn)、腳墊增厚、跗關(guān)節(jié)明顯腫大（飛節(jié)和趾節(jié)較為嚴(yán)重）、用手觸摸有波動(dòng)感，診斷疑似為MS 感染。本試驗(yàn)通過病雞的臨床癥狀診斷、病理組織剖檢、血清平板凝集試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)、基因序列比對(duì)和同源性分析進(jìn)行綜合診斷，最終確診為MS 感染，為進(jìn)一步防控和凈化雞滑液囊支原體病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2019 年12 月采自云南昆明某肉雞養(yǎng)殖公司具有MS典型癥狀的病雞樣品3只。

1.1.2 試劑及耗材

TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2xEasyTaq PCR SuperMIX（tdge）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。陽性參考菌株、滑液囊支原體平板凝集試驗(yàn)抗原、陽性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清平板凝集試驗(yàn)

參照GB/T 17999.4—2008《血清平板凝集試驗(yàn)》要求進(jìn)行樣品的血清平板凝集試驗(yàn)。

1.2.2 引物的合成

根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的MS 的基因序列，利用Oligo7設(shè)計(jì)1對(duì)引物，MS-F引物：AAATCAGGCTCGGGC CCT，MS-R 引物：AGTAACCGATCCGCTTAATGC，擴(kuò)增片段374 bp，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

1.2.3 病料采集及DNA提取

無菌采集腫脹關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液滲出物和內(nèi)容物、胸部龍骨旁干酪樣壞死物和增厚腳墊內(nèi)容物，黏液用生理鹽水稀釋。按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 使用說明書提取DNA，共提取3 份DNA。

1.2.4 PCR檢測(cè)

利用MS 檢測(cè)引物MS-F、MS-R 對(duì)上述提取的DNA進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增 。 PCR 反 應(yīng) 體 系 25 μL：2×Easy TaqSuperMix（tdge）12.5 μL、sterile ddH2O 9.5 μL、上下游引物各 1 μL。1 號(hào)加 1 μL 陽性菌株 DNA；2 號(hào)加 1 μL 的ddH2O；3、4、5 號(hào)各加入 1 μL 的 DNA 模板。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后把PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。

1.2.5 測(cè)序和核苷酸同源性分析

將膠回收產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，使用DNAStar 軟件，對(duì) 3 株分離株（YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019）與 GenBank 中的 16 株 MS 參考毒株進(jìn)行16S rRNA 核苷酸序列同源性分析。參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息Tab.1 Reference strain information

2 結(jié)果與分析

2.1 病雞臨床癥狀和病理變化（見圖1）

圖1 病雞病理變化Fig.1 Pathological changes in sick chickens

對(duì)病雞進(jìn)行抗生素治療，效果不明顯，發(fā)病數(shù)量仍在增加。詢問免疫程序，1日齡接種馬立克病疫苗；4日齡接種傳染性支氣管炎疫苗；7、21 日齡接種新城疫疫苗；14、28日齡接種法氏囊疫苗。

所觀察的雞為2 只土雜雞、1 只瑤雞。由圖1 可知，臨床癥狀為病雞雞冠輕微萎縮呈蒼白色、羽毛混亂、消瘦脫水、?？s頭閉眼、行走時(shí)步態(tài)蹣跚；跗骨關(guān)節(jié)腫脹變粗（飛節(jié)和趾節(jié)較為嚴(yán)重）、用手觸摸有波動(dòng)感、腳墊增厚嚴(yán)重、行走的姿態(tài)呈輕微的八字步、胸部的皮下組織發(fā)生腫脹。

病理變化：剖檢病雞腫脹的關(guān)節(jié)和腳掌末端，發(fā)現(xiàn)有大量黏稠的黃色膿液的流出、胸部觸摸明顯增厚、有壞死灶形成；剖檢病雞的腺胃，發(fā)現(xiàn)里面基本沒有內(nèi)容物、看不到明顯的病理變化、脾腎等器官正常；剖檢病雞的氣管未發(fā)現(xiàn)出血點(diǎn)，只有少量黏液。

2.2 病雞血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，經(jīng)過血清平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)，3份血清陽性率為100%。

圖2 病雞平板凝集試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Plate agglutination test results in sick chickens

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，在374 bp位置可見清晰、明亮的特異性條帶，與預(yù)期條帶相符。

2.4 同源性分析結(jié)果（見圖4）

圖3 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis result of PCRproduct

對(duì)分離株 YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019 與GenBank 中的16 株參考毒株進(jìn)行序列同源性分析。由圖5 可知，YNKM1-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~99.6%，其中與MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 的同源性最高，為99.6%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。YNKM2-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~100%，其中與YNKM3-2019 的同源性最高，為100%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。YNKM3-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~99.6%，其中與MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 四株的同源性最高，為99.6%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。

圖4 同源性分析結(jié)果Fig.4 Homology analysis results

3 討論

近年來，云南省內(nèi)MS發(fā)病率較高，但對(duì)本病的病原分離鑒定和相關(guān)研究較少。目前還未研發(fā)出針對(duì)性的藥物，不能根除該病，只能控制雞群感染率，降低發(fā)病率[11]。MS感染確診的方法有病原分離鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。病原分離鑒定可靠性較高，培養(yǎng)后分離細(xì)菌進(jìn)行瑞士染色，在油鏡下和培養(yǎng)基上觀察形態(tài)來確定[12]。血清學(xué)診斷常用的有血清平板凝集試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、酶連免疫吸附試驗(yàn)等[13]。臨床中常用PCR檢測(cè)法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高[14-15]。為確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最終需要使用多種檢測(cè)方法來確診。

本研究采用血清學(xué)方法和病原分離鑒定對(duì)云南昆明某肉雞場(chǎng)疑似感染MS的病雞進(jìn)行診斷。首先進(jìn)行血清平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果3份病料樣品均為陽性；然后從特征性病理變化的腫脹關(guān)節(jié)內(nèi)容物中提取DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在374 bp 處有清晰的特異性條帶；最后將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與Genbank中下載的16條參考序列進(jìn)行比對(duì)，再通過同源性分析發(fā)現(xiàn)其同源性在94.2%~99.6%之間，確診為MS。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)疑似MS 感染的臨床病料，通過提取DNA、PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，清晰無雜帶即可快速診斷，為治療該病節(jié)省時(shí)間，此方法適合規(guī)?；B(yǎng)殖的防控和凈化監(jiān)測(cè)。