梁瑞鈺，黎梓城，汪龍飛，鮑 蕾，李 丹*，潘靜靜，鐘懷寧，鄭建國*

(1.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.雀巢(中國)食品安全研究院，北京 100015)

熒光增白劑(Fluorescent whitening agents,FWAs)多具有共軛雙鍵發(fā)色基團，可吸收太陽光中不可見的紫外線，使分子激活后再回到基態(tài)，在此過程中將能量較低的藍、紫光反射出來，從而抵消紙纖維中的微黃色或灰白色，提高產(chǎn)品的亮度，因此熒光增白劑在造紙業(yè)中得到廣泛使用[1-2]。部分研究表明熒光增白劑會對人體健康帶來不良影響，該類物質(zhì)與皮膚直接接觸可能存在致敏反應(yīng)[3-4]，吸入人體內(nèi)會產(chǎn)生蓄積作用，削弱人體免疫力和傷口愈合能力[5]，加重肝臟負擔(dān)，甚至可能誘發(fā)細胞癌變[6-7]。對此，國內(nèi)外出臺了相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范熒光增白劑的使用。歐盟法規(guī)2002/72/EC規(guī)定了塑料食品接觸材料中熒光增白劑C.I.184的特定遷移量為0.6 mg/kg[8]。德國聯(lián)邦風(fēng)險評估所(Federal institute for risk assessment，BfR)規(guī)定焙烤用紙不得使用著色劑或熒光增白劑[9]。我國GB 9685-2016[10]中規(guī)定了熒光增白劑393、184和236在塑料等材質(zhì)中的特定遷移限量和最大使用量，但GB 4806.8-2016[11]中規(guī)定食品包裝用紙中檢出熒光性物質(zhì)為陰性。

目前，熒光增白劑的測定方法主要有紫外燈照射法、紫外-可見分光光度法[12]、熒光分光光度法[13-14]、高效液相色譜-熒光法[15-17]、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18]和超高效合相色譜法[19]。前3種方法操作簡單，可對試樣中的熒光增白劑進行快速定性分析，但只能實現(xiàn)熒光增白劑總量的測定，而色譜法則可實現(xiàn)熒光增白劑的良好分離和準(zhǔn)確測定[17-18]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27741-2018采用紫外可見分光光度法和高效液相色譜實現(xiàn)了可遷移性熒光增白劑的定性定量分析，檢出限分別為20.0 mg/kg和1.0 mg/kg，但該標(biāo)準(zhǔn)未包括GB 9685-2016中規(guī)定限量的熒光增白劑[10,15]。目前熒光增白劑的色譜分析方法主要針對離子型和非離子型熒光增白劑分別開展，且主要采用C18柱進行分離，而對于兩種類型熒光增白劑的同時測定研究較少。

本文選擇目前使用較為廣泛、成本較低的離子型熒光增白劑和歐盟及我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的C.I.184和C.I.393等作為研究對象，包括離子型和非離子型熒光增白劑，以及部分同分異構(gòu)體，采用簡便的前處理方式，利用熒光增白劑的熒光特性選擇高效液相色譜-熒光檢測器進行分析。方法可實現(xiàn)食品接觸紙制品中15種熒光增白劑的良好分離和同時檢測，且簡便可靠。在本文設(shè)定的檢出限濃度下，利用紫外燈照射法驗證發(fā)現(xiàn)15種熒光增白劑無明顯熒光現(xiàn)象，方法的靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀配置熒光檢測器(沃特世公司)；Agilent Pursuit 5 PFP液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5.0 μm，安捷倫公司)；Agilent Eclipse XDB-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5.0 μm，安捷倫公司)；AS 7240BT超聲振蕩器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Sigma 3K15 離心機(德國Sigma公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：熒光增白劑368(C.I.368，CAS:5242-49-9)、熒光增白劑367(C.I.367，CAS:5089-22-5)、熒光增白劑135(C.I.135，CAS:1041-00-5)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；熒光增白劑378(C.I.378，CAS:40470-68-6)、熒光增白劑71(C.I.71，CAS:16090-02-1)、熒光增白劑220(C.I.220，CAS:16470-24-9)購于上海安譜實驗科技股份有限公司；熒光增白劑199(C.I.199A，CAS:13001-38-2)購于加拿大TRC公司；熒光增白劑24(C.I.24，CAS:12224-02-1)購于美國國際實驗室；熒光增白劑134(C.I.134，CAS:3426-43-5)和熒光增白劑113(C.I.113，CAS:12768-92-2)購于北京曼哈格生物科技有限公司；熒光增白劑199(C.I.199B，CAS:13001-40-6)、熒光增白劑393(C.I.393，CAS:1533-45-5)、熒光增白劑351(C.I.351，CAS:27344-41-8)、熒光增白劑184(C.I.184，CAS:7128-64-5)、熒光增白劑140(C.I.140，CAS:91-44-1)、四丁基溴化銨(TBA)、三乙胺、二氯甲烷、三氯甲烷和二甲基甲酰胺(DMF)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇、乙腈均為HPLC級，購于Fisher公司。實驗用水均為一級純凈水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的15種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品(C.I.220、C.I.24、C.I.113、C.I.134、C.I.71、C.I.351和C.I.378、C.I.393以及C.I.135、C.I.140、C.I.368、C.I.184、C.I.367、C.I.199A、C.I.199B),分別使用70%DMF水溶液和三氯甲烷以及二氯甲烷溶解后，轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中定容，所得標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于-20 ℃冰箱中避光密閉保存。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液中C.I.220、C.I.24和C.I.113的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，C.I.393和C.I.378的質(zhì)量濃度為40 mg/L，其余10種熒光增白劑的質(zhì)量濃度為100 mg/L。

1.3 提取實驗

將食品接觸紙制品切碎后，準(zhǔn)確稱取2.00 g，加入20 mL堿性提取液(乙腈-水-三乙胺體系，體積比為40∶60∶1)，超聲提取50 min，靜置后用聚四氟乙烯(PTFE)針式濾膜過濾并上機測試，平行制樣2份。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Pursuit 5 PFP(4.6 mm×250 mm×5.0 μm);流動相：A相為10 mmol/L TBA甲醇水溶液(甲醇∶水=5∶95)，B相為乙腈，C相為甲醇；流速為0.5 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；熒光檢測器的激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長為440 nm，梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure of HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇本研究的15種熒光增白劑包括6種離子型和9種非離子型熒光增白劑，其中還存在部分同分異構(gòu)體(C.I.220和C.I.24以及C.I.199A和C.I.199B)。離子型熒光增白劑主要采用C18柱進行分析，而苯基柱對具有相似苯環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有較好的分離效果[3,20]，因此分別考察了常規(guī)C18柱(4.6 mm×250 mm×5.0 μm)和Pursuit 5 PFP苯基柱(4.6 mm×250 mm×5.0 μm)對15種熒光增白劑的分離效果。結(jié)果表明，C18柱對于離子型熒光增白劑C.I.220、C.I.24和C.I.113的分離度較好，但對同分異構(gòu)體C.I.199A和C.I.199B及結(jié)構(gòu)類似的熒光增白劑難以實現(xiàn)色譜分離。Pursuit 5 PFP柱對離子型的熒光增白劑保留較強，色譜峰出現(xiàn)重疊，而對于非離子型和具有相似結(jié)構(gòu)的熒光增白劑的色譜分離效果較好。因此最終選擇Pursuit 5 PFP柱，并通過調(diào)節(jié)流動相比例和增加分析時間改善離子型熒光增白劑的色譜分離效果。

2.1.2流動相的選擇本研究對流動相中有機相的種類進行了優(yōu)化[19]。分別考察了甲醇-水、甲醇-TBA甲醇水溶液以及甲醇-乙腈-TBA甲醇水溶液作為流動相對15種熒光增白劑色譜分離的影響。結(jié)果表明，TBA甲醇水溶液可以改善離子型熒光增白劑的色譜分離效果，加入乙腈可以有效分離C.I.135和C.I.199A，因此本研究采用甲醇-乙腈-TBA甲醇水溶液為流動相(圖1)。

圖1 最佳流動相條件下15種熒光增白劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 15 FWAs in optimal mobile phase conditionthe peak numbers denoted were the same as those in Table 2

同時考察了流動相中TBA甲醇水溶液pH值(pH 5、6、7、8、9)對15種熒光增白劑色譜分離效果的影響，結(jié)果表明pH值的影響不顯著，為簡化實驗操作不對流動相pH值進行調(diào)節(jié)。此外，考察了流動相流速(0.5、0.8、1.0 mL/min)對15種熒光增白劑色譜分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)流速越大出峰時間越早。但C.I.393由于保留較強，色譜峰出現(xiàn)較為嚴(yán)重的拖尾。因此，綜合考慮后選擇流動相流速為0.5 mL/min。

2.1.3激發(fā)波長與發(fā)射波長的選擇熒光檢測器激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇對于提高方法靈敏度具有重要意義。本研究通過掃描得到最大激發(fā)波長為370 nm，再通過最大激發(fā)波長掃描發(fā)射波長，得到最大發(fā)射波長為440 nm，此時熒光增白劑的響應(yīng)最佳，靈敏度較高。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化綜合考慮熒光增白劑的溶解性和后續(xù)與液相色譜的兼容性，考察了甲醇、乙腈、DMF、70%DMF和堿性提取液(乙腈-水-三乙胺體系，體積比為40∶60∶1)5種提取溶劑對紙制品中熒光增白劑的提取效果(如圖2)。對比發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈對熒光增白劑的提取效果較差，堿性提取液的提取效果最佳，這是由于堿性環(huán)境有利于提取樣品中的離子型熒光增白劑。DMF可增強熒光增白劑的熒光響應(yīng)，有效提高分析方法的靈敏度，但其提取效率較堿性提取液弱，因此選擇堿性提取液作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對熒光增白劑提取量的影響Fig.2 Effects of extraction solvent on the extraction capacity of FWAs

此外，還考察了提取液和樣品的分離方式，分別對比了離心和不同濾膜(PTFE和尼龍)過濾方式下熒光增白劑的提取量。結(jié)果表明，尼龍濾膜過濾后提取液中熒光增白劑的含量明顯較低，可能是尼龍濾膜在過濾過程中對熒光增白劑產(chǎn)生了吸附作用。離心處理與PTFE濾膜過濾后熒光增白劑的含量相當(dāng)，但考慮到紙制品中的纖維質(zhì)量輕，易分散，常規(guī)離心過程難以完全沉淀，因此采用PTFE濾膜過濾方式。

2.2.2提取時間與提取溶劑體積的優(yōu)化考察了超聲提取時間(20、30、40、50、60 min)對熒光增白劑提取量的影響。結(jié)果顯示，超聲提取50 min時提取量達最大值，此后隨著超聲時間的延長，提取效率略微下降，可能是由于超聲時間過長導(dǎo)致熒光增白劑發(fā)生降解所致。因此選擇超聲提取時間為50 min。此外，還考察了不同提取溶劑體積(10、20、30、40、50 mL)對熒光增白劑提取量的影響，結(jié)果表明提取溶劑體積為20 mL時提取量較高。為節(jié)省溶劑用量和提高提取效率，選擇提取溶劑體積為20 mL。

2.3 線性范圍與定量下限

按本方法對15種熒光增白劑的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以分析物的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，15種熒光增白劑在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 9～0.999 9。以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD)，10倍信噪比確定定量下限(LOQ)，15種熒光增白劑的LOD為0.030～0.60 mg/kg，LOQ為0.10～2.0 mg/kg(表2)。此外，利用紫外燈照射法驗證發(fā)現(xiàn)，在本文的LOD濃度下15種熒光增白劑均無熒光現(xiàn)象，證明本方法可實現(xiàn)對較低含量熒光增白劑的定量分析。

表2 15種熒光增白劑的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 2 Linear relations,LODs and LOQs of 15 FWAs

2.4 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在陰性樣品中加入一定量的熒光增白劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置低、中、高3個加標(biāo)水平，每個加標(biāo)水平平行測定6次，對高濃度的加標(biāo)樣液稀釋2.5倍并經(jīng)樣品前處理后上機測定。表3結(jié)果表明，15種熒光增白劑的回收率為90.0%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.70%～7.1%，方法的精密度和準(zhǔn)確度均能滿足定量分析要求。

表3 15種熒光增白劑在3個加標(biāo)水平下的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of 15 FWAs at three spiked levels

2.5 實際樣品測定

采用本方法對市售的13種紙制品(廚房用紙、紙板、硅油紙、紙盤和牛皮紙)進行檢測，結(jié)果表明1款紙盤中檢出C.I.220，含量為650 mg/kg(圖3A)；另有1款紙盤中檢出C.I.220，含量為978 mg/kg；1款紙板中檢出C.I.220和C.I.393，含量分別為12、0.39 mg/kg(圖3B)；1款廚房用紙中檢出C.I.24，含量為16 mg/kg(圖3C)；其余樣品均未檢出待測熒光增白劑。

圖3 紙盤1(稀釋50倍，A)、紙板(B)與廚房用紙(C)陽性樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of paper plate 1 (A,diluted 50 times),cardboard(B) and kitchen paper(C) positive samples

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-熒光法同時測定食品接觸紙制品中15種熒光增白劑含量的方法，操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高，其線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度等方法學(xué)參數(shù)均滿足定量分析的要求。該方法已成功用于食品接觸紙制品中熒光增白劑含量的測定，對食品接觸紙制品質(zhì)量安全的管理和控制具有一定的指導(dǎo)意義。