鄭旭玲，殷 文，陳 俊，李 裕，戴 宗，鄒小勇

(1.中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.中山大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

成熟的microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為19～23個(gè)堿基的非編碼RNA[1]。諸多證據(jù)表明，miRNA在包括細(xì)胞分化、早期發(fā)育、增殖、凋亡等眾多生命活動(dòng)過(guò)程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2-3]，其表達(dá)水平與許多疾病密切相關(guān)，可作為疾病標(biāo)志物和用于基因治療以及作為潛在的藥物靶點(diǎn)[4]。開發(fā)可靠、簡(jiǎn)單、高效的miRNA檢測(cè)方法對(duì)于疾病的早期診斷具有重要意義。

近年來(lái)，基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增策略的miRNA檢測(cè)方法獲得極大發(fā)展，如滾環(huán)擴(kuò)增[5]、雜交鏈反應(yīng)[6]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[7]等線性擴(kuò)增反應(yīng)被成功應(yīng)用于miRNA定量分析和細(xì)胞成像分析。相比之下，指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)是一種在短時(shí)間可獲得高擴(kuò)增效率(106～109)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，為miRNA的快速有效檢測(cè)帶來(lái)了便利[8]。EXPAR方法通常采用一個(gè)含兩段重復(fù)序列的對(duì)稱DNA模板，目標(biāo)序列與模板的3′端互補(bǔ)雜交后，在聚合酶的作用下沿著模板延伸；延伸出的雙鏈DNA包含切口酶識(shí)別序列，被切口酶切割，并在DNA聚合酶的鏈置換作用下被釋放出來(lái)，進(jìn)一步與另一條模板的3′端進(jìn)行雜交和擴(kuò)增，形成指數(shù)形式的擴(kuò)增[9]。但這些方法存在如下問(wèn)題：(1)擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率仍有待提高。miRNA的準(zhǔn)確分析有賴于擴(kuò)增方法的效率和特異性。當(dāng)前的擴(kuò)增方法，指數(shù)擴(kuò)增的效率很高，但更高階的擴(kuò)增方法很難獲得；為提高擴(kuò)增效率，往往需要復(fù)雜的設(shè)計(jì)和多擴(kuò)增模板共同參與，且易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。(2)擴(kuò)增反應(yīng)的序列依賴性問(wèn)題有待解決[10-11]。在大多數(shù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，擴(kuò)增模板序列不同，往往導(dǎo)致靶標(biāo)與模板的結(jié)合力改變，引起擴(kuò)增效率改變。這一缺陷限制了方法的通用性，不利于對(duì)多目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。

針對(duì)上述問(wèn)題，本文提出了一種基于“Y”型結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的低序列依賴恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法(Y-EXPAR)。根據(jù)目標(biāo)miRNA的識(shí)別序列設(shè)計(jì)兩個(gè)模板，兩部分互補(bǔ)的模板與目標(biāo)miRNA形成Y型結(jié)構(gòu)，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內(nèi)切酶作用下，引發(fā)雙向恒溫指數(shù)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)miRNA的快速檢測(cè)分析。let-7b在細(xì)胞過(guò)程和人類疾病中扮演著重要角色，在肺癌、乳腺癌等幾種人類惡性腫瘤組織中呈低水平表達(dá)，且與其他let-7家族成員僅存在1～4個(gè)堿基差異[12-13]。本研究以let-7b為目標(biāo)miRNA模型，探究了Y-EXPAR方法的檢測(cè)靈敏度、特異性和抗干擾性，以及在檢測(cè)不同CG含量的目標(biāo)miRNA時(shí)的序列依賴性，并將本策略應(yīng)用于A549細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7b表達(dá)量的檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)線性和恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法，本策略能有效解決序列依賴性問(wèn)題，且提高了擴(kuò)增效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

DEPC處理水(Diethyl pyrocarbonate)、dNTPs、蛋白酶K和RNA酶抑制劑(上海生工生物工程公司)；寡聚核苷酸鏈的合成(序列如表1所示，上海生工生物工程公司)；Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶、10×Nt.BstNBI buffer(25 mmol/L Tris-HCl,pH 7.9,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L EDTA)、10×ThermoPol buffer(10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100)(北京紐英倫生物技術(shù)有限公司)；SYBR Green I(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清、鏈霉素、青霉素、胰蛋白酶和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)；人類肺癌細(xì)胞(A549，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用的核酸堿基序列*Table 1 Sequences of the oligonucleotides used in this work*

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Y-EXPAR方法的建立取離心管置于冰上，分別配制A和B溶液。A溶液包含目標(biāo)miRNA、擴(kuò)增模板T1和T2、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。B溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶和SYBR Green I。A和B溶液準(zhǔn)備好后立即混合，加入適量DEPC處理水使溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer，1×ThermoPol buffer，0.1 μmol/L T1，0.075 μmol/L T2，1 000 μmol/L dNTPs，0.06 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶，0.4 U/μL Nt.BstNBI 內(nèi)切酶和 0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System 實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad，USA)，溫度設(shè)置為45 ℃，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)時(shí)間間隔為30 s。

1.2.2EXPAR方法檢測(cè)miRNA 參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，本實(shí)驗(yàn)基于EXPAR檢測(cè)miRNA的步驟如下：取離心管置于冰上，分別配制C和D溶液。C溶液包含目標(biāo)miRNA、擴(kuò)增模板T7、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。D溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶、SYBR Green I和DEPC處理水。C和D溶液準(zhǔn)備好后立即混合，溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer、1×ThermoPol buffer、0.1 μmol/L T7、250 μmol/L dNTPs、0.05 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶、0.4 U/μL Nt.BstNBI內(nèi)切酶和0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad，USA)，溫度設(shè)置為55 ℃，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)時(shí)間間隔為30 s。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%(體積比)胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，并在37 ℃含5% CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)A549細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞收集和裂解使用胰蛋白酶消化，以1 000 r/min離心5 min除去培養(yǎng)基收集A549細(xì)胞系。將細(xì)胞用RPMI-1640徹底清洗3次，加入RPMI-1640得到細(xì)胞濃度約1 000個(gè)/μL的重懸液，用RPMI-1640將懸浮的細(xì)胞溶液逐級(jí)稀釋至所需濃度。取1 μL細(xì)胞溶液放入置于冰上的0.2 mL PCR管，管中裝有0.9% NaCl溶液和40 U/mL RNase抑制劑，將細(xì)胞樣品迅速放入液氮中冷凍2 min后在98 ℃下熱處理3 min，再浸入液氮中，反復(fù)3次，使細(xì)胞膜破裂。為消化與miRNA結(jié)合的蛋白，將樣品與1 U蛋白酶K和10 U RNase抑制劑于53 ℃下孵育1 h，再于85 ℃下孵育20 min使蛋白酶解。處理后的細(xì)胞裂解液放在液氮中保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

本文以let-7b為目標(biāo)miRNA模型，Y-EXPAR方法的原理如圖1所示。設(shè)計(jì)兩個(gè)DNA單鏈模板，模板T1的c序列和模板T2的c′互補(bǔ)，T1的b′與目標(biāo)miRNA(let-7b)中的b互補(bǔ)，T2的a′與目標(biāo)miRNA中的a互補(bǔ)。當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時(shí)，T1、T2和目標(biāo)miRNA三者的互補(bǔ)序列雜交形成“Y”型結(jié)構(gòu)。在DNA聚合酶和dNTPs作用下進(jìn)行雙向延伸，目標(biāo)miRNA沿T1從5′端向3′端延伸形成DNA雙鏈，T1則沿T2延伸，兩個(gè)方向延伸形成的雙鏈DNA中均產(chǎn)生Nt.BstNBI內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，引導(dǎo)內(nèi)切酶進(jìn)行剪切后，具有鏈置換活性的DNA聚合酶從切口的3′端繼續(xù)延伸，置換釋放與d互補(bǔ)的寡核苷酸d′。第一輪擴(kuò)增，1個(gè)目標(biāo)miRNA理論上產(chǎn)生2個(gè)d′序列；第二輪擴(kuò)增，“Y”型結(jié)構(gòu)重復(fù)“擴(kuò)增-剪切-釋放”的過(guò)程，同時(shí)，2個(gè)d′序列與體系中剩余的模板T1和T2結(jié)合，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內(nèi)切酶作用下理論上擴(kuò)增產(chǎn)生2個(gè)d′，共產(chǎn)生4個(gè)d′；依次類推，第三輪擴(kuò)增將釋放8個(gè)d′，第n輪擴(kuò)增釋放2n個(gè)d′，實(shí)現(xiàn)d′序列的指數(shù)擴(kuò)增。利用熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA的特異性結(jié)合，可定量體系中生成的雙鏈DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光變化檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程積聚的產(chǎn)物。該Y-EXPAR方法操作簡(jiǎn)便，可在45 ℃的恒溫下進(jìn)行；相比傳統(tǒng)EXPAR方法，擴(kuò)增效率更高，可快速對(duì)目標(biāo)miRNA進(jìn)行檢測(cè)；“Y”型結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)將目標(biāo)miRNA的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為以已知序列為觸發(fā)劑的擴(kuò)增，擺脫目標(biāo)序列不同對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響，有效避免序列依賴性，提高對(duì)不同miRNA檢測(cè)的適用性。方法有望在miRNA以及短鏈核酸分析方面提供高效快速的通用分析方法。

圖1 Y-EXPAR方法的原理圖Fig.1 Principle scheme of Y-EXPAR method

2.2 “Y”型結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增速率的影響

配制相同濃度的let-7b溶液，以T1和T2為模板進(jìn)行Y-EXPAR反應(yīng)，使用T7為模板進(jìn)行EXPAR反應(yīng)。如圖2所示，EXPAR反應(yīng)和Y-EXPAR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間增加而指數(shù)升高。不同的是，相比EXPAR，Y-EXPAR能夠更快進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增階段，顯著縮短反應(yīng)所需總時(shí)間。指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增速率可以用POI值(Point of inflection,POI)表示，即實(shí)時(shí)熒光曲線的最大斜率處(拐點(diǎn))所對(duì)應(yīng)的時(shí)間。

圖2 EXPAR和Y-EXPAR方法響應(yīng)1 pmol/L let-7b的實(shí)時(shí)熒光曲線圖Fig.2 Real-time fluorescence curves of EXPAR and Y-EXPAR in response to 1 pmol/L let-7b,respectively

Y-EXPAR反應(yīng)的POI值為7，EXPAR的POI值為18.5，表明Y-EXPAR具有更高的擴(kuò)增效率。因?yàn)樵贓XPAR方法的第一輪擴(kuò)增中，let-7b與單鏈模板T7結(jié)合后，DNA聚合酶以dNTPs為底物，使let-7b沿著模板T7延長(zhǎng)形成雙鏈，內(nèi)切酶剪切后產(chǎn)生等量寡核苷酸。相比之下，Y-EXPAR反應(yīng)在第一輪擴(kuò)增中，let-7b與兩個(gè)模板T1、T2共同形成“Y”型結(jié)構(gòu)，從兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶的識(shí)別和切割，能夠釋放雙倍數(shù)量的寡核苷酸d′序列，引發(fā)更多的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，促使反應(yīng)速率增高。

2.3 Y-EXPAR方法的可行性分析

miRNA同源家族中的成員序列相似度高[14]，因此，對(duì)miRNA的檢測(cè)需方法具有高特異性。為探究Y-EXPAR的特異性，本文使用let-7家族的不同成員進(jìn)行測(cè)試。let-7家族成員的序列高度相似，let-7b與let-7c之間僅相差1個(gè)堿基，與let-7a、7d～7g、7i之間相差2～4個(gè)堿基。圖3A以T1和T2為模板，Y-EXPAR方法分別響應(yīng)濃度為100 pmol/L的let-7b，以及l(fā)et-7x(let-7a、7c～7g、7i)所獲得的實(shí)時(shí)熒光曲線。結(jié)果顯示，響應(yīng)let-7b的實(shí)時(shí)熒光曲線強(qiáng)度增速遠(yuǎn)快于響應(yīng)let-7x的熒光曲線，表明let-7家族成員間雖然具有序列高度相似性，但Y-EXPAR方法仍能夠有效區(qū)分let-7b與其他let-7家族成員，顯示了較強(qiáng)的特異性。

POIx為let-7x實(shí)時(shí)熒光曲線的POI值，根據(jù)POI值與let-7b濃度的相關(guān)方程：POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)，可得到POIx對(duì)應(yīng)的let-7b濃度。將該相對(duì)濃度記為Alet-7x。通過(guò)系數(shù)(I%)評(píng)估本方法的特異性，計(jì)算公式如式(1)[15]。濃度相同時(shí)，相比let-7b，let-7x產(chǎn)生的信號(hào)非常微弱，其中，let-7i對(duì)應(yīng)的I最大，但也僅為3.54×10-7%，表明Y-EXPAR方法具有優(yōu)異的特異性，可區(qū)分目標(biāo)miRNA和相似序列。

(1)

Y-EXPAR方法還展現(xiàn)了良好的抗干擾性。將let-7b與let-7a、7c～7g、7i分別混合配制7種混合樣品?；旌象w系中目標(biāo)miRNA濃度為10 fmol/L，干擾miRNA濃度為其1 000倍，即10 pmol/L。利用Y-EXPAR方法對(duì)混合miRNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。如圖3B所示，10 fmol/L的let-7b樣品所對(duì)應(yīng)的POIlet-7b約為8.00，含有干擾miRNA(let-7x)的混合樣品對(duì)應(yīng)的POIlet-7x在6.67～9.00之間。與前述方法相同，根據(jù)POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)，由POIlet-7b和POIlet-7x分別計(jì)算相對(duì)濃度Alet-7b和Alet-7x。通過(guò)計(jì)算系數(shù)(S%)評(píng)估let-7x對(duì)let-7b濃度檢測(cè)產(chǎn)生的干擾，計(jì)算公式如式(2)，系數(shù)越小特異性越強(qiáng)[15]。計(jì)算得S%為0.064%～7.47%。其中，let-7d和let-7g引起的干擾極小，分別為0.074%和0.064%，這是因?yàn)槎吲clet-7b相比均存在4個(gè)堿基錯(cuò)配?？傮w而言，Y-EXPAR方法具有良好的抗干擾性。

(2)

2.4 Y-EXPAR方法序列依賴性研究

EXPAR方法在檢測(cè)不同miRNA時(shí)，擴(kuò)增性能差別較大，其擴(kuò)增效率在一定程度上依賴于模板序列[11]。Y-EXPAR中“Y”型結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)可降低目標(biāo)miRNA序列變化對(duì)擴(kuò)增效率的影響，改善序列依賴性問(wèn)題。當(dāng)目標(biāo)miRNA不再是let-7b時(shí)，Y-EXPAR方法只需改變模板T1中的b′序列和模板T2中的a′序列，而T1中的c、d、e、d和T2中的c′、d、e、d無(wú)需變換。

CG的比例會(huì)影響雙鏈的穩(wěn)定性。模板/觸發(fā)雙鏈中CG含量低，熔解溫度Tm值小，觸發(fā)劑與模板結(jié)合力弱；反之，CG含量高，熔解溫度Tm高，觸發(fā)劑與模板容易結(jié)合，但新形成的觸發(fā)劑難以解離[11]。使用CG含量不同的miRNA檢驗(yàn)Y-EXPAR方法的序列依賴性。由let-7b的序列計(jì)算得知，let-7b的CG含量為45.5%。根據(jù)miRBase的數(shù)據(jù)[16]，本文對(duì)48 885種miRNA的CG含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選出CG含量較低和較高的miRNAs，并選擇與人類相關(guān)的兩種miRNAs：miR-374a和miR-762(CG含量分別為22.7%和90.9%，堿基數(shù)目均為22個(gè)，與let-7b相同)進(jìn)行考察。

作為對(duì)照，本文根據(jù)EXPER方法的原理為let-7b、miR-374a、miR-762分別設(shè)計(jì)模板T7、T8、T9，其擴(kuò)增結(jié)果如圖4A所示?？梢钥吹紼XPER方法檢測(cè)濃度為10 fmol/L的miR-374a、let-7b、miR-762時(shí)，獲得的POI值差別明顯，分別為7.00、18.8和34.5，說(shuō)明即使是擴(kuò)增原理相同，對(duì)于不同GC含量的核酸，擴(kuò)增效果差異依然很明顯。該差異會(huì)導(dǎo)致分析性能的明顯變化。在10 fmol/L～100 pmol/L濃度范圍內(nèi)，let-7b的POI值隨濃度增加逐漸下降，而miR-374a和miR-762的POI值則無(wú)明顯變化。

相比之下，根據(jù)Y-EXPAR方法的測(cè)定原理，為miR-374a設(shè)計(jì)了模板T3和T4，為miR-762設(shè)計(jì)了模板T5和T6。如圖4B所示，隨著miRNAs濃度的增加，Y-EXPAR的擴(kuò)增速率提高，let-7b、miR-374a和miR-762三種目標(biāo)miRNA所對(duì)應(yīng)的POI值均下降；在相同miRNA濃度下，let-7b、miR-374a和miR-762的POI值接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Y-EXPAR方法檢測(cè)不同miRNA時(shí)，即使目標(biāo)miRNA序列改變較大(GC值變化大)，模板仍能保持良好的擴(kuò)增性能。DNA聚合酶將核苷酸整合到延長(zhǎng)鏈中的速率與DNA模板的序列相關(guān)[11]。在Y-EXPAR方法中，目標(biāo)miRNA與兩個(gè)模板形成“Y”型結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增釋放d′，接下來(lái)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)由觸發(fā)劑d′引發(fā)。檢測(cè)不同目標(biāo)miRNA時(shí)，d′的序列無(wú)需改變，避免了DNA聚合酶和不同DNA序列相互作用時(shí)的差異，降低了Y-EXPAR的序列依賴性。

2.5 Y-EXPAR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5.1反應(yīng)溫度Y-EXPAR方法中，反應(yīng)溫度不僅能影響Nt.BstNBI內(nèi)切酶和Vent(exo-) DNA聚合酶活性，還影響目標(biāo)miRNA與模板雜交形成“Y”型結(jié)構(gòu)，觸發(fā)劑與模板的結(jié)合，以及新合成的觸發(fā)劑從模板上的解離等。因此，需要對(duì)Y-EXPAR的反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。由圖5A可知，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的實(shí)時(shí)熒光曲線的POI差值(ΔPOI)最大。因此，將45 ℃作為Y-EXPAR的最佳反應(yīng)溫度。

2.5.2Nt.BstNBI內(nèi)切酶用量在Y-EXPAR方法中，Nt.BstNBI內(nèi)切酶切割新生鏈，產(chǎn)生更多觸發(fā)劑進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。本文探究了Nt.BstNBI內(nèi)切酶用量對(duì)Y-EXPAR方法檢測(cè)性能的影響(圖5B)。當(dāng)Nt.BstNBI內(nèi)切酶為0.04 U/μL時(shí)，let-7b與空白對(duì)照間的熒光響應(yīng)區(qū)分最為明顯，二者之間的ΔPOI最大，同時(shí)，Y-EXPAR方法保持較高反應(yīng)效率；當(dāng)Nt.BstNBI內(nèi)切酶濃度增至0.05 U/μL時(shí)，Y-EXPAR方法的效率進(jìn)一步提高，但let-7b與空白對(duì)照之間的熒光響應(yīng)差異減小。因此，將0.04 U/μL作為Y-EXPAR反應(yīng)中 Nt.BstNBI 內(nèi)切酶的最佳酶量。

2.5.3Vent(exo-)DNA聚合酶用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理可知，DNA聚合酶在Y-EXPAR方法中能夠沿著模板延長(zhǎng)互補(bǔ)鏈，并將切割后的DNA鏈置換下來(lái)。因此，DNA聚合酶用量將影響Y-EXPAR方法對(duì)miRNA的檢測(cè)能力。如圖5C可知，當(dāng)Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.04 U/μL時(shí)，Y-EXPAR的反應(yīng)速度最慢；隨著DNA聚合酶濃度增至0.06 U/μL，Y-EXPAR的反應(yīng)效率加快，空白對(duì)照的非特異性信號(hào)也增強(qiáng)；繼續(xù)增加Vent(exo-) DNA聚合酶濃度至0.08 U/μL和0.10 U/μL，Y-EXPAR的反應(yīng)效率變化較小。根據(jù)ΔPOI和DNA聚合酶濃度的關(guān)系圖，當(dāng)DNA聚合酶為0.06 U/μL時(shí)，ΔPOI最大，表明let-7b產(chǎn)生的熒光信號(hào)與空白對(duì)照的非特異性信號(hào)相差最大，Y-EXPAR方法能更好地區(qū)分let-7b和空白對(duì)照。因此，將0.06 U/μL作為Y-EXPAR反應(yīng)中Vent(exo-) DNA聚合酶的最佳酶量。

2.6 Y-EXPAR分析能力研究

本文以T1和T2為模板，在反應(yīng)溫度為45 ℃，Nt.BstNBI內(nèi)切酶濃度為0.04 U/μL，Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.06 U/μL的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的let-7b進(jìn)行Y-EXPAR擴(kuò)增。圖6展示了各濃度let-7b產(chǎn)生的實(shí)時(shí)熒光曲線。隨let-7b濃度的增加，擴(kuò)增速率加快。如圖6插圖所示，在1 amol/L～10 nmol/L濃度范圍，實(shí)時(shí)熒光曲線的POI值與let-7b濃度的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系，線性方程為：POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)(r2= 0.969)。本方法的檢出限為0.3 amol/L，相當(dāng)于10 μL溶液中約有1.8拷貝的let-7b；且在保持良好檢測(cè)能力的同時(shí)，所需檢測(cè)時(shí)間僅為10 min，比常規(guī)EXPAR所需時(shí)間更短。Y-EXPAR方法能夠有效進(jìn)行生物樣品中miRNA的檢測(cè)。

圖6 Y-EXPAR響應(yīng)不同濃度let-7b的實(shí)時(shí)熒光曲線圖Fig.6 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to different concentrations of let-7b let-7b concentration(1-10)：blank,1 amol/L,10 amol/L,1 fmol/L,10 fmol/L,100 fmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L;insert:plot of corresponding POI value and logarithm of let-7b concentration

2.7 細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7b的檢測(cè)分析

miRNA被認(rèn)為是臨床上重要的生物標(biāo)志物[17]。研究表明，let-7b能夠抑制幾種參與肺癌發(fā)展的蛋白質(zhì)翻譯[13,18]，且肺癌患者的腫瘤組織和周圍組織中的let-7b表達(dá)顯著降低[13]。本文應(yīng)用Y-EXPAR方法檢測(cè)了人類肺癌細(xì)胞A549中l(wèi)et-7b的表達(dá)量。在100個(gè)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中加入足量let-7b的反義核苷酸，以此作為陰性對(duì)照，運(yùn)用Y-EXPAR方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光曲線最大斜率對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，陰性對(duì)照的POI為13，緩沖溶液空白對(duì)照的POI為13.5，二者非常接近，表明Y-EXPAR方法可以在細(xì)胞裂解液的環(huán)境中進(jìn)行目標(biāo)miRNA的檢測(cè)分析。

運(yùn)用Y-EXPAR方法對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，如圖7所示，隨著細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞裂解液所對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光曲線強(qiáng)度增長(zhǎng)減慢，反應(yīng)時(shí)間增加。且細(xì)胞數(shù)目在1～1 000范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞裂解液所對(duì)應(yīng)實(shí)時(shí)熒光曲線的POI值與細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系，回歸方程為POI=10.2-1.30lg(Number of cells)。結(jié)果表明Y-EXPAR方法在檢測(cè)細(xì)胞中的miRNA方面具有較好效果，在臨床診斷中具有應(yīng)用潛力。

圖7 Y-EXPAR響應(yīng)不同數(shù)目A549細(xì)胞裂解液的實(shí)時(shí)熒光曲線圖Fig.7 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to cell lysates from different numbers of A549numbers of A549(1-5):blank,1,10,100,1 000 cells

3 結(jié) 論

本文提出了一種基于DNA“Y”型結(jié)構(gòu)的高擴(kuò)增效率、低序列偏好的指數(shù)型核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法——Y-EXPAR，并將其應(yīng)用于miRNA的靈敏特異檢測(cè)。該方法延續(xù)了傳統(tǒng)EXPAR方法的主要優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)可在恒溫下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)在檢測(cè)let-7b和其它let-7家族時(shí)表現(xiàn)出良好的選擇特異性和抗干擾能力。此外，“Y”型結(jié)構(gòu)還實(shí)現(xiàn)了雙向指數(shù)擴(kuò)增，進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率，縮短了分析時(shí)間。對(duì)于引發(fā)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的觸發(fā)劑而言，“Y”型結(jié)構(gòu)能夠保證擴(kuò)增反應(yīng)的相對(duì)獨(dú)立性，有效克服擴(kuò)增序列依賴性問(wèn)題。本擴(kuò)增方法為miRNA的快速檢測(cè)提供了新思路，在miRNA相關(guān)的疾病研究和臨床診斷方面具有良好應(yīng)用前景。