杜琨

摘要：以分離于高原酸奶中的乳酸菌Z103為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定蔗糖、大豆蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4、NaCl、牛肉膏、Na2HPO4、（NH4）2SO4、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度和pH值對(duì)產(chǎn)抑菌物質(zhì)活力的影響，應(yīng)用響應(yīng)面法的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液pH 值7.0、裝液量40 mL、大豆蛋白胨含量 9.6 g/L 時(shí)可獲得抑菌物質(zhì)最大抑菌圈直徑為1.350 cm，優(yōu)化后乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的效價(jià)較優(yōu)化前提高了41.17%。該模型能科學(xué)地預(yù)測(cè)抑菌物質(zhì)的合成情況。響應(yīng)面法可有效、成功地優(yōu)化抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件。

關(guān)鍵詞：抑菌物質(zhì);乳酸乳球菌;響應(yīng)面法;發(fā)酵條件;優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0155-07

從高原酸奶中分離出產(chǎn)抑菌物質(zhì)的乳酸菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，生產(chǎn)出活性高、抑菌普廣的抑菌物質(zhì)，該種抑菌物質(zhì)有廣闊的發(fā)展前景，主要原因在于：抑菌活性高，比nisin的抑菌活性高得多;成本低，安全性高;來(lái)源廣泛。因此，從高原酸奶中生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的研究備受國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注。

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design）是一種經(jīng)濟(jì)有效的二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[1-3]，它可以從眾多考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素[4-7]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化生物過(guò)程的綜合技術(shù)，可同時(shí)對(duì)影響生物產(chǎn)量的因子水平及交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)[8-11]，快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該法已被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[12]、提取技術(shù)和酶學(xué)性質(zhì)的研究[13-16]、異黃酮[17-18]及藥物的作用[19-20]等研究方面。利用JMP（Version 4.0.5，SAS Institute Inc.，1989—2001）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)影響乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的各方面因素進(jìn)行優(yōu)化研究，篩選出主要影響因子。在此基礎(chǔ)上，借助Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)主要影響因子的最佳水平及其交互作用做進(jìn)一步研究，以期獲得較高產(chǎn)量的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生產(chǎn)菌：乳酸乳球菌Z103菌株，由西藏高原酸奶中分離得出。 ?檢測(cè)指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。該試驗(yàn)于2018年12月在陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。

1.2 主要試劑

蔗糖、酵母浸膏、MgSO4·7H2O、NaCl 、牛肉膏、大豆蛋白胨、Na2HPO4·12H2O、（NH4）2SO4、KH2PO4、亮氨酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：1%大豆蛋白胨、1%酵母浸膏、0.5%NaCl、0.05%MgSO4·7H2O、0.034%亮氨酸、0.5%蔗糖、pH值6.8。

活化培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L蔗糖、10 g/L大豆蛋白胨、10 g/L酵母浸膏、10 g/L牛肉膏 、0.4 g/L MgSO4·7H2O、5 g/L NaCl、18 g/L Na2HPO4 ·12H2O、12 g/L （NH4）2SO4。

發(fā)酵液效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基：1%酵母浸膏、1%大豆蛋白胨、0.5% NaCl、pH值7.0。

1.4 主要儀器與設(shè)備

TQHZ-2002A恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠;GHP-250恒溫培養(yǎng)箱，揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司;SB-3S-1無(wú)菌操作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;XY280B不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司;GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器設(shè)備有限公司;GHP-250智能光照培養(yǎng)箱，揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5. 菌種活化 將保藏的乳酸菌和金黃色葡萄球菌斜面菌種轉(zhuǎn)接至各自的活化培養(yǎng)基，分別于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)18 h，使菌體恢復(fù)生理活性。

1.5.2 種子瓶培養(yǎng) 以2%的接種量將培養(yǎng)了 18 h 的Z103菌株轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)液中，于30 ℃ 150 r/min 的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 h備用。

1.5.3 發(fā)酵培養(yǎng) 依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按設(shè)計(jì)接種量分別接種于不同的處理中，按設(shè)計(jì)溫度置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min培養(yǎng)24 h。

1.5.4 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性測(cè)定方法 將供試菌種接種培養(yǎng)（37 ℃培養(yǎng)24 h）后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)活化好的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將菌液濃度調(diào)至106 CFU/mL。用改進(jìn)濾紙片法測(cè)量抑菌圈大小。

1.5.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.5.1 主成分分析 在單因素基礎(chǔ)上對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行主成分設(shè)計(jì)，降維篩選出影響顯著的前3個(gè)因子，最終再結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。主成分試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

1.5.5.2 響應(yīng)面分析 試驗(yàn)選取通過(guò)降維分析得到的3個(gè)因子作為響應(yīng)因子，見(jiàn)圖1，以發(fā)酵清液抑菌圈直徑作為響應(yīng)值（Y1），通過(guò)Box-Behnken Design進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

1.5.6 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最理想的5組發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并進(jìn)行相關(guān)距離分析，驗(yàn)證產(chǎn)生高原乳酸菌素模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z103菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子的確定

對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行分析，建立Z103菌株代謝產(chǎn)量初步回歸模型：

Y1=1.374 375-0.016 875x1+0.030 625x2-0.010 625x3+0.011 875x4+0.006 875x5+0.005 625x6+0.000 625x7+0.029 375x8-0.038 125x9-0.004 375x10+0.013 125x11+0.106875x12。（1）

由式（1）可知，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)代謝產(chǎn)量與蔗糖含量、酵母浸膏含量、裝液量和接種量呈負(fù)相關(guān)，而與其余響應(yīng)因子均呈正相關(guān)。由表4方差分析看出，誤差項(xiàng)不顯著，而多元回歸系數(shù)R2=0.953 7，說(shuō)明回歸方程（1）能夠在95.37%的置信度上解釋響應(yīng)因子對(duì)響應(yīng)值的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的二次數(shù)學(xué)模型基本符合，模型與實(shí)際情況擬合程度較好，可用于對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)代謝產(chǎn)量影響的預(yù)測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

由方差分析表還可知，響應(yīng)因子對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)代謝產(chǎn)量影響的順序?yàn)閤12>x9>x2>x8>x1>x11>x4>x3>x5>x6>x10>x7，即pH值>裝液量>大豆蛋白胨含量>（NH4）2SO4含量>蔗糖含量>發(fā)酵溫度>MgSO4·7H2O含量>酵母浸膏含量>NaCl含量>KH2PO4添加量>接種量>Na2HPO4·12H2O含量。其中最重要的3個(gè)因素為發(fā)酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量。用此3個(gè)因子再做響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以確定最佳發(fā)酵條件。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化Z103菌株發(fā)酵條件

2.2.1 預(yù)測(cè)模型的建立及回歸分析檢驗(yàn) 利用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3中響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，獲得關(guān)于編碼自變量pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y1=1.278 69-0.024 923x1-0.028 395x2-0.016 052x3+0.002 178x21-0.022 063x1x2-0.023 528x1x3+0.0377 82x22+0.011 91x2x3-0.025 396x23。（2）

由表5方差分析可知， 本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（P=0.014 1<0.05）;失擬項(xiàng)P值（0.373 0）較大，表明相對(duì)于純誤差而言，失擬項(xiàng)不顯著，多元擬合系數(shù)R2=0.939 9，表明僅有6.01%的Z103菌株代謝產(chǎn)量總變異不能由此模型進(jìn)行解釋，其實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合程度，可以用該方程對(duì)不同發(fā)酵條件下的響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由表5還可以看出，發(fā)酵液pH值和裝液量的一次項(xiàng)、裝液量和大豆蛋白胨含量的二次項(xiàng)均具有極顯著性;大豆蛋白胨含量的一次項(xiàng)、發(fā)酵液pH值和裝液量的交互項(xiàng)以及發(fā)酵液pH值和大豆蛋白胨含量的交互項(xiàng)顯著。對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)， 表明發(fā)酵液pH值和裝液量的二次項(xiàng)以及裝液量和大豆蛋白胨含量的交互項(xiàng)對(duì)Z103菌株代謝產(chǎn)量影響呈正效應(yīng)，其余各因子對(duì)其影響為負(fù)效應(yīng)，回歸模型的F值為8.695 478，P等于0.014 1，說(shuō)明模型的回歸效果顯著具有實(shí)際應(yīng)用意義。剔除二次回歸方程中不顯著項(xiàng)，優(yōu)化后的回歸模型方程為

Y=1.278 69-0.024 923x1-0.028 395x2-0.016 052x3+0.037 782x22-0.025 396x23-0.022 063x1x2-0.023 528x1x3。（2）

2.2.2 Z103菌株代謝產(chǎn)量響應(yīng)面分析與優(yōu)化 由圖2見(jiàn)，固定大豆蛋白胨含量為零水平，當(dāng)發(fā)酵液pH值不變且處于較低水平時(shí)，隨著裝液量的升高響應(yīng)值呈開(kāi)口向上的拋物線;而發(fā)酵液pH值處于較高水平時(shí)，隨著裝液量水平增加，響應(yīng)值幾乎呈線性下降，之后略有上升。當(dāng)固定裝液量不變且處于較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵液pH值升高響應(yīng)值有小幅增加，二者呈線性變化;當(dāng)固定裝液量不變且處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵液pH值的升高響應(yīng)值呈線性下降，且變化幅度較大。從發(fā)酵液pH值和裝液量交互作用的等高線圖（圖2右）可以看出，響應(yīng)值對(duì)裝液量的變化更為敏感。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了響應(yīng)面圖分析的正確性。

由圖3可見(jiàn)，固定裝液量為零水平，當(dāng)發(fā)酵液pH值不變且處于較低水平時(shí)，隨著大豆蛋白胨含量的升高響應(yīng)值迅速增加，之后略有下降;而當(dāng)發(fā)酵液pH值不變且處于較高水平時(shí)，隨著大豆蛋白胨含量的增加，響應(yīng)值先略有上升，之后迅速下降。當(dāng)固定大豆蛋白胨含量不變且處于較低水平時(shí)，響應(yīng)值隨發(fā)酵液pH值變化趨勢(shì)不明顯;當(dāng)固定大豆蛋白胨含量不變且處于較高水平時(shí)，隨著發(fā)酵液pH值的升高響應(yīng)值則呈線性下降，且變化幅度較大。從發(fā)酵液pH值和大豆蛋白胨含量交互作用的等高線圖（圖3右）可以看出，響應(yīng)值對(duì)大豆蛋白胨含量的變化更為敏感。

由以上響應(yīng)面圖可知，發(fā)酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量三者之間的交互作用出現(xiàn)鞍面，無(wú)極值的存在，說(shuō)明不能從二次響應(yīng)面上找出最佳參數(shù)，需進(jìn)一步做嶺脊分析，見(jiàn)表6。

利用SAS 9.2進(jìn)行分析，得到回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，當(dāng)編碼半徑為1.0時(shí)響應(yīng)值Y（即抑菌圈直徑）最大，約為1.347 36，此時(shí)優(yōu)化參數(shù)為發(fā)酵液pH值7.0，裝液量40 mL，大豆蛋白胨含量9.6 g/L。

2.3 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)上述回歸模型，采用SAS 9.2軟件優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得Z103菌株的最適發(fā)酵條件為發(fā)酵液pH值 7.0，裝液量40 mL，大豆蛋白胨含量9.6 g/L，在此條件下抑菌圈直徑可達(dá)到1.347 36 cm。采用上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果獲得的抑菌圈直徑為1.350 cm，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.48%;并且未進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的效價(jià)為850.26 IU/mL，優(yōu)化后抑菌物質(zhì)的效價(jià)達(dá)到 1 200.32 IU/mL，較優(yōu)化前提高了41.17%。證明采用響應(yīng)面法對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。

3 討論與結(jié)論

Z103菌株的代謝產(chǎn)物受發(fā)酵條件的影響很大，因此，對(duì)Z103菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和外在條件進(jìn)行優(yōu)化研究十分必要。孫帥等都利用單因子和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行過(guò)研究[21-24]。Sen等采用響應(yīng)曲面法對(duì)脂肽surfactin發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究[25-26]。但這些研究主要是針對(duì)乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素發(fā)酵條件的研究，對(duì)從高原酸奶中提取能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的Z103菌株的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基方面的研究報(bào)道較少。

本試驗(yàn)采用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種經(jīng)濟(jì)有效的二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它的主因素為正交設(shè)計(jì)，兩因素之間的交互作用僅部分與主因素產(chǎn)生混淆。響應(yīng)曲面法是一種優(yōu)化生物技術(shù)過(guò)程的綜合技術(shù)方法，它可以建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生物過(guò)程的因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，可快速確定多因子的最佳條件[27]。與傳統(tǒng)方法相比，響應(yīng)曲面法試驗(yàn)次數(shù)少，節(jié)省人力物力，已被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化的實(shí)踐中。

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)省時(shí)省力，可快速有效地從諸多相關(guān)因素中篩選出主要影響的內(nèi)在因素和外部因素，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)曲面法建立數(shù)學(xué)模型，利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)效價(jià)較原來(lái)提高了41.17%。

通過(guò)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)主成分的分析，優(yōu)選出對(duì)Z103菌株代謝產(chǎn)量有主要影響的3個(gè)因子為發(fā)酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量。

失擬項(xiàng)P值較大，表明相對(duì)于純誤差而言，失擬項(xiàng)不顯著，多元擬合系數(shù)R2=0.939 9，表明僅有6.01%的Z103菌株發(fā)酵產(chǎn)物總變異不能由此模型進(jìn)行解釋，其實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合程度，可以用該方程對(duì)不同發(fā)酵條件下的響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由嶺脊分析結(jié)果得出Z103菌株最佳發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件為發(fā)酵液pH值7.0，裝液量為40 mL，大豆蛋白胨含量為9.6 g/L。

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