段思宇 陳庚 高青青 郭兆寬 段柯兆 張廣輝 楊生超 趙艷

摘要：采用Folin-Ciocalte法測定雪膽中的多酚含量，研究金屬離子和溫度對多酚穩(wěn)定性的影響，并分析多酚對 α-淀粉酶活性的抑制作用和抑制類型。結(jié)果表明，Mn2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+對多酚具有破壞作用，其中Mn2+對多酚的破壞作用最顯著;溫度過高或者過低不利于多酚的保存，溫度在25～45 ℃多酚保存效果最佳;酶促動力學(xué)研究表明，雪膽多酚對α-淀粉酶具有抑制作用，其抑制作用類型為可逆競爭性抑制，表明雪膽具有開發(fā)為輔助降糖保健食品或藥品的價值。

關(guān)鍵詞：雪膽;多酚;穩(wěn)定性;α-淀粉酶;抑制作用;金屬離子

中圖分類號： R284 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0167-05

雪膽（Hemsleya chinensis）主要分布在我國西南地區(qū)的云南省和四川省[1-2]，具有清熱解毒等功效，可用于治療支氣管炎、細菌性痢疾和肺結(jié)核等[3]，具有很高的藥用價值，為常用傳統(tǒng)藥材[4-7]。多酚是一種次生代謝產(chǎn)物[8]，主要通過莽草酸和丙二酸途徑合成。植物多酚廣泛分布于植物的皮、根、葉和果肉中，大部分多酚類化合物為水溶性物質(zhì)，存在于植物液泡中，天然存在形式較多。多酚類化合物是天然的抗氧化劑，除了有良好的抗氧化功能外，還具有保護植物免受紫外線傷害[9]、抑制細菌[10-11]等作用。多酚的酚羥基在光照等條件下容易被氧化，氧化后顏色加深。一些多酚物質(zhì)能與 α-淀粉酶相互作用，從而抑制α-淀粉酶的活性[12]，這種抑制作用能有效阻礙食物中碳水化合物的水解和消化[13]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者已對雪膽化學(xué)成分、藥理活性、作用機制等方面進行了研究[4，6-7，14-15]。植物中多酚具有良好的生物活性，已成為醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的研究重點之一。然而，多酚在加工或貯藏等過程中，易受到溫度、光照和金屬離子等的影響而被降解，其抗氧化活性降低。α-淀粉酶是可以影響飲食中淀粉等主要碳水化合物消化和吸收的關(guān)鍵酶，抑制α-淀粉酶的活性能有效降低淀粉等物質(zhì)的降解和葡萄糖的吸收，從而有效控制血糖的快速升高;因此，從中草藥的天然產(chǎn)物中獲得α-淀粉酶抑制劑已成為研究熱點。但有關(guān)雪膽多酚在貯藏過程中的穩(wěn)定性和對α-淀粉酶抑制活性的研究還鮮有報道。因此，筆者對雪膽多酚的穩(wěn)定性和雪膽多酚對α-淀粉酶抑制類型進行研究，旨在為雪膽多酚的保存和加工以及今后的綜合開發(fā)利用提供理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

2018年7月雪膽塊莖采自云南柯兆生物科技有限公司的雪膽資源圃，其已由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超教授鑒定。試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心完成。

所用試劑為α-淀粉酶（Sigma公司）、福林酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑、阿卡波糖，均為國產(chǎn)分析純。所用儀器為722N型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、電子天平[賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司公司]、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 雪膽多酚的提取及含量測定

將雪膽干燥塊莖經(jīng)過粉碎過篩，通過回流提取獲得雪膽多酚提取液。根據(jù)Folin-Ciocalte法，在765 nm波長下測定提取液吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算雪膽總多酚濃度。

1.3 雪膽多酚穩(wěn)定性試驗

1.3.1 金屬離子的影響 取20 mL多酚提取液加入比色管中，分別加入1、5、10 mg/mL Na+、K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Al3+、Fe3+溶液 1 mL，每個處理3次重復(fù)，放置1 d后于765 nm波長下測定溶液吸光度。

1.3.2 溫度的影響 取30 mL多酚提取液加入比色管中，把比色管分別置于25～85 ℃下恒溫水浴 5 h，同一溫度下每隔1 h測定1次溶液吸光度，計算雪膽總多酚濃度和多酚保存率。

1.3.3 雪膽多酚保存率的計算 根據(jù)提取液處理前后的多酚濃度，計算雪膽多酚的保存率，計算公式如下：

1.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制作用

1.4.1 α-淀粉酶活性測定 取α-淀粉酶溶液，于37 ℃恒溫水浴放置15 min后，添加底物溶液 0.2 mL，混勻后添加 DNS試劑1 mL，于沸水浴中放置5 min，冷卻后添加蒸餾水15 mL，于540 nm波長下測定溶液吸光度。同時以磷酸鹽緩沖溶液作空白對照。

1.4.2 酶反應(yīng)動力學(xué)進程曲線的建立 分別量取0.1～0.5 mL濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶溶液于比色管中。隨后將比色管于37 ℃恒溫水浴中放置 15 min，添加底物溶液0.2 mL，混勻后添加DNS試劑1 mL，于沸水浴中放置5 min后及時冷卻，添加蒸餾水 15 mL，于540 nm波長下測定溶液吸光度。

1.4.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制效果 取 1 mg/mL α-淀粉酶溶液0.3 mL，分別添加不同濃度的多酚溶液1 mL?；旌弦夯靹蚝笥?7 ℃恒溫水浴中放置15 min，添加底物溶液0.2 mL、DNS試劑 1 mL，混勻后沸水浴5 min，及時冷卻并添加蒸餾水15 mL，于540 nm波長處測定吸光度;同時磷酸鹽緩沖溶液作空白對照，阿卡波糖作陽性對照，每個處理3次重復(fù)。計算雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制率，公式如下：

1.4.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制機制 在底物濃度為0.5%的條件下，按照“1.4.1”節(jié)中的方法，以0.5 mg/mL為間隔，在540 nm下測定濃度范圍為0.5～2.5 mg/mL內(nèi)的α-淀粉酶溶液的吸光度，并計算反應(yīng)初始速率。以α-淀粉酶濃度和反應(yīng)初始速率為橫縱坐標(biāo)作圖，確定雪膽多酚提取液對α-淀粉酶的抑制作用類型（可逆或不可逆）。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

以Excel 2013作圖分析，數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0進行單因素方差分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為0～9 μg/mL沒食子酸對應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程：y=0.067 2x-0.062 7（r2=0.999 7）。

2.2 雪膽多酚穩(wěn)定性分析

2.2.1 金屬離子對多酚穩(wěn)定性的影響 不同金屬離子對雪膽多酚含量影響程度不同。由圖1可知，離子濃度的增大使含有不同金屬離子樣液的多酚含量出現(xiàn)變化，同時樣液顏色也有所改變。當(dāng)雪膽多酚溶液中含有Na+、K+、Mg2+時，其多酚含量和顏色與空白對照組相比無明顯差別，可知這3類離子對多酚穩(wěn)定性幾乎無影響。由觀察可知，Mn2+對雪膽多酚的影響最為明顯，Mn2+加入后，溶液立刻變得渾濁且有絮狀沉淀生成。Fe2+、Fe3+分別加入后，溶液逐漸變得渾濁，但無肉眼可見的沉淀產(chǎn)生。圖1表明，隨Fe2+、Fe3+離子濃度的增大，雪膽多酚含量逐漸增加，其中離子濃度為10 mg/mL時多酚含量的增加最顯著，表明高濃度Mn2+、Fe2+、Fe3+可能破壞了雪膽多酚結(jié)構(gòu);Cu2+加入后，樣液顏色明顯變化，但Cu2+的加入使多酚濃度減少，表明多酚結(jié)構(gòu)可能被破壞，穩(wěn)定性受到了影響。因此，雪膽多酚保存時，應(yīng)盡量避免接觸Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+。

2.2.2 溫度對多酚穩(wěn)定性的影響 如圖2所示，溫度對雪膽多酚含量變化有顯著影響。溫度為45～85 ℃ 時，隨加熱時間的延長， 多酚濃度整體呈下降

趨勢，且溫度越高多酚濃度整體下降趨勢越明顯。保溫5 h后，45、65、85 ℃條件下的雪膽多酚濃度降低，表明高溫條件下，多酚類物質(zhì)化學(xué)及空間結(jié)構(gòu)遭到破壞或降解。保溫5 h后，45、65、85 ℃條件下的雪膽多酚保存率依次為94.29%、91.95%、89.10%，推測高溫條件下多酚類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞或降解。保溫5 h后，25 ℃條件下多酚含量增加，原因可能是低溫抑制了部分酶的活性，減弱了氧化作用，能有效延緩氧化、聚合和降解。處理5 h后的樣液顏色變淺，推測這是由于多酚中呈色的花色苷類物質(zhì)在熱處理下易氧化，且溫度越高，氧化速率越快。由此可見，在25～45 ℃時，雪膽多酚的熱穩(wěn)定性較好。

2.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制作用

2.3.1 建立酶反應(yīng)動力學(xué)進程曲線 通過建立不同α-淀粉酶用量的反應(yīng)動力學(xué)進程曲線，確定能使酶反應(yīng)初始速率達到最大值的最適酶量和最適反應(yīng)時間。如圖3所示，隨著α-淀粉酶用量的增加，反應(yīng)初始速率逐漸增快，綜合考慮酶量與反應(yīng)時間的關(guān)系，確定最適酶量為0.3 mL，反應(yīng)時間為3 min。

2.3.2 Km和Vmax的確定 以1/v和1/[S]為橫、縱坐標(biāo)作圖， 得到α-淀粉酶的米氏方程曲線（圖

4），直線的橫縱截距分別表示1/Km的絕對值和 1/vmax。由此可以計算出米氏常數(shù)Km=11.628 mg/mL，最大反應(yīng)速率vmax=0.137 mg/（mL·min），從而得到α-淀粉酶的米氏方程式：

由r2=0.998 4可知，該酶促反應(yīng)與米氏方程較吻合，該方程也可用于對催化反應(yīng)進行機理分析和應(yīng)用性評價。

2.3.3 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制效果分析 測定0.60～6.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)的雪膽多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制作用。由圖5可知，隨雪膽多酚濃度增大，抑制率呈現(xiàn)上升趨勢。

2.4 雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制機制分析

2.4.1 抑制類型分析 以酶濃度和反應(yīng)初始速率為橫縱坐標(biāo)作圖，當(dāng)存在可逆抑制劑時，速率直線過原點且斜率較低;當(dāng)存在不可逆抑制劑時，速率直線不通過原點;當(dāng)不存在抑制劑時，速率直線通過原點但斜率大于存在可逆抑制劑。如圖6所示，無抑制組直線的斜率大于抑制組直線的斜率且2條直線均通過原點，表明雪膽多酚對α-淀粉酶的抑制類型是可逆性抑制。

2.4.2 可逆性抑制類型分析 以抑制劑濃度和 1/v 為橫縱坐標(biāo)作圖，當(dāng)抑制類型為競爭性抑制時，不同底物濃度所對應(yīng)直線相交但交點不在橫坐標(biāo)上;而當(dāng)抑制類型為非競爭性抑制時，兩直線相交且交點在橫坐標(biāo)上;當(dāng)抑制類型為反競爭性抑制時，則不相交。如圖7所示，底物濃度分別為0.5%、1.0%的2條直線相交但交點不在橫坐標(biāo)上，說明雪膽多酚對α-淀粉酶活性的可逆抑制屬于競爭性抑制。

3 討論與結(jié)論

本研究從資源利用的角度出發(fā)，探討了金屬離子、溫度對雪膽多酚穩(wěn)定性的影響。岳鑫的研究表明，溫度變化對紅松多酚的穩(wěn)定性有顯著影響，并發(fā)現(xiàn)紅松多酚對光敏感，在金屬離子中Fe3+對其的破壞作用最為明顯[17]。仇洋發(fā)現(xiàn)低溫條件對黑果腺肋花楸多酚穩(wěn)定性有利，同時發(fā)現(xiàn)受到Ca2+、Cu2+、K+等6種金屬離子影響，黑果腺肋花楸多酚穩(wěn)定性被破壞，其中Cu2+的破壞作用最大[18]。楠極等在番石榴葉多酚穩(wěn)定性的研究中表明，Zn2+、Fe2+和Fe3+均會影響多酚提取液的穩(wěn)定性[19]。馬雙雙等發(fā)現(xiàn)蓮子殼多酚的穩(wěn)定性受溫度和金屬離子的影響，其中Fe3+、Fe2+、Cu2+等6種離子對多酚的穩(wěn)定性有顯著的破壞作用，溫度越高，降解程度越強[20]。在蘋果果皮和果肉多酚穩(wěn)定性的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)溫度越高，果皮、果肉中的總酚類物質(zhì)含量越低[21]。由于多酚類物質(zhì)具有抗氧化性[11]、抗衰老[22]、抑菌性[23]等功效，因此探討保存溫度、金屬離子等因素對多酚穩(wěn)定性的影響，確保能夠最大程度地保存雪膽多酚避免損失具有重要意義。

本研究以可溶性淀粉為底物測定雪膽多酚對 α-淀粉酶活性的抑制作用，表明其抑制作用屬于可逆性的競爭性抑制類型。在黑果腺肋花楸多酚對 α-淀粉酶的抑制作用研究中，也發(fā)現(xiàn)隨著多酚濃度的上升抑制率增加，抑制類型屬于可逆非競爭性抑制[18]。柳梅等發(fā)現(xiàn)以沙棘葉為原料分離純化得到的提取物對豬胰α-淀粉酶具有一定的抑制作用，其抑制作用屬于可逆反競爭性抑制[24]。伍城穎等發(fā)現(xiàn)芡種皮多酚提取物對α-淀粉酶的抑制作用與濃度間存在量效關(guān)系，抑制類型為可逆性的競爭性抑制[25]。本研究探討了影響雪膽多酚穩(wěn)定性的因素，以及對α-淀粉酶活力抑制的動力學(xué)研究，為今后雪膽多酚的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，對于提高雪膽的附加值和雪膽資源的有效利用具有重要意義。

雪膽多酚抗Na+、K+、Zn2+、Mg2+和Al3+的干擾能力強，抗Mn2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+的干擾能力較弱，特別是應(yīng)盡量避免與Mn2+接觸;雪膽多酚對溫度較為敏感，溫度高于45 ℃，隨溫度升高和加熱時間延長，多酚保留率明顯下降，25～45 ℃多酚穩(wěn)定性較好。雪膽多酚具有明顯的抑制作用，得到α-淀粉酶的米氏方程為v=0.137 mg/（mL·min）×[S]11.628 mg/mL+[S];雪膽多酚對α-淀粉酶活性屬可逆性抑制劑，其可逆抑制類型為競爭性抑制類型。研究結(jié)果可為雪膽多酚的保存和加工以及今后的綜合開發(fā)利用提供理論參考和依據(jù)。

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