謝啟明 柯瑞林 劉帆 蘇時萍

摘要：為研究安徽省鱖魚的遺傳多樣性，對安徽省內(nèi)5個鱖魚養(yǎng)殖群體共125個樣本的線粒體D-loop區(qū)進(jìn)行了擴增和測序分析。試驗最終共獲得125條長度為858 bp的D-loop區(qū)序列，共檢出260個變異位點，包括77個簡約信息位點和183個單核苷酸變異位點;堿基平均含量為T（29.3%）、C（20.6%）、A（33.8%）和G（16.2%），具有明顯的（A+T）堿基偏移。5個群體的遺傳多樣性較低（Hd，mean=0.596，Pi，mean=0.0 053），可能經(jīng)歷了瓶頸事件。此外，通過對群體遺傳結(jié)構(gòu)及鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹的分析發(fā)現(xiàn)，5個養(yǎng)殖群體未表現(xiàn)出明顯地理聚集，不同群體間有少量個體混合。群體變異主要來自于群體內(nèi)部而非群體間。本研究可為鱖魚種質(zhì)資源的保護(hù)和恢復(fù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鱖（Siniperca chuatsi）;線粒體基因組;D-loop區(qū);遺傳多樣性

中圖分類號： S932.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0143-05

鱖（Siniperca chuatsi），隸屬硬骨魚綱、鱸形目、鱸形科、鱖亞科、鱖屬，廣泛分布于中國南部，是一種具有較高經(jīng)濟價值的特色魚類。安徽省是內(nèi)陸漁業(yè)大省，擁有全國第二大的水域總面積，水域生態(tài)良好、水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品產(chǎn)量穩(wěn)居全國前四。近年，安徽省一直在大力推進(jìn)綠色生態(tài)養(yǎng)殖和特色水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)，及漁業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟體系的轉(zhuǎn)型。安徽省作為翹嘴鱖的兩大主產(chǎn)地之一，具有得天獨厚的優(yōu)勢。然而天然水域的破壞和過度商業(yè)捕撈，使得鱖魚的野生資源迅速減少，并且大規(guī)模的集中養(yǎng)殖又缺乏充足的親本補充，常常發(fā)生近親繁殖，使得生產(chǎn)性狀退化，種質(zhì)資源丟失。為緩解種質(zhì)質(zhì)量與生產(chǎn)需求間的矛盾，改良生產(chǎn)性狀，提高經(jīng)濟效益，并為優(yōu)良品種的選育提供科學(xué)依據(jù)，開展鱖種群遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)的分析非常重要。

遺傳多樣性是生物進(jìn)化與適應(yīng)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)，其豐富程度反映了生物的進(jìn)化與適應(yīng)潛力的強弱。近年來，已有不少關(guān)于鱖魚遺傳多樣性的研究。如胡玉婷等基于線粒體Cyt b基因分析了安徽省養(yǎng)殖黃金鱖（翹嘴鱖選育種）群體與3個野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，4個群體具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸遺傳多樣性并發(fā)生了遺傳分化[1]。曾慶凱等基于10對微衛(wèi)星引物分析了3個野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性，得到了相似的結(jié)果[2]。顏元杰等基于20對微衛(wèi)星引物分析了江蘇省6個野生翹嘴鱖群體，結(jié)果表明其具有較高的遺傳多樣性[3]。然而，有關(guān)安徽省翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性研究并不多見。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一種理想的分子標(biāo)記，具有無重組、多拷貝無內(nèi)含子等特點[4]。mtDNA的不同區(qū)域具有不同的進(jìn)化速率，如進(jìn)化速率較低的12S rDNA、16S rDNA等用于科的標(biāo)記;進(jìn)化速率適中的Cyt b、CO Ⅰ用于屬、種的標(biāo)記;進(jìn)化速率較高的D-loop區(qū)用于種群內(nèi)部的標(biāo)記[5]。

本研究基于能夠反映種群內(nèi)部遺傳多樣性的線粒體D-loop區(qū)引用，分析來自安徽省的5個翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)，旨在為翹嘴鱖的品種選育與改良工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

翹嘴鱖樣品均采集自安徽省內(nèi)，包括肥東縣管灣水產(chǎn)養(yǎng)殖場（GW）、池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司（QP）、安慶市皖宜季牛水產(chǎn)養(yǎng)殖場（AQ）、滁州市隆財漁業(yè)有限公司（CZ）和明光市廣源水產(chǎn)養(yǎng)殖場（MG），共5個群體，每個群體25個樣本，取背部肌肉組織于無水乙醇中4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 翹嘴鱖線粒體DNA的抽提 翹嘴鱖肌肉組織使用上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（LG-0107）新鮮動物組織和細(xì)胞線粒體DNA抽提試劑盒抽提線粒體DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 翹嘴鱖D-loop區(qū)的擴增、測序 翹嘴鱖 D-loop區(qū)引物設(shè)計以NCBI：NC_015822為模板，使用Primer 5.0設(shè)計引物。F：5′-CCCAAAGCTAGGATTGTAAAC-3′;R：5′-CGGATACTTGCATGTGTAAG-3′，委托上海桑尼生物科技有限公司合成。

PCR擴增使用50 μL體系：Premix Taq（TaKaRa Taq Version2.0 plus dye）（25 μL），20 μmol/μL 的上游引物（1 μL），20 μmol/μL的下游引物（1 μL），DNA模板（2 μL），ddH2O補充至50 μL。

擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后一個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳初步確定片段長度后，由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化、測序。

1.2.3 遺傳多樣性和群體分化分析 序列的比對和堿基組成使用MEGAX[6]分析。序列的變異位點、核苷酸多樣性（Pi）、單倍型多樣性（Hd）、基因流（Nm）和分化系數(shù)（FST）使用DNAsp 5.0分析[7]。分子變異分析（A-MOVA）使用PopART8分析。

1.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖使用PopART[8]構(gòu)建。鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGAX6構(gòu)建，并進(jìn)行1 000次的Boot strap檢驗。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性和群體分化分析

測序返回的序列數(shù)據(jù)經(jīng)人工校正、比對去除兩端冗余序列、Blast驗證序列同源性后，共獲得150條長度為883 bp的D-loop區(qū)序列用以下游分析。

150條序列共檢出65個變異位點，包括18個簡約信息位點和47個單堿基變異位點;堿基平均含量為T（29.3%）、C（20.6%）、A（33.8%）和G（16.2%），具有明顯的（A+T）堿基偏倚。

由表1可知，多數(shù)群體具有較高的單倍型多樣性（0.33～0.71），其中，GW與AQ群體單倍型多樣性最高（0.71），只有QP群體較低（0.33<0.5）。除Hap 2、Hap 4、Hap 12為多群體共享單倍型外，其余均為群體內(nèi)獨有單倍型，其中MG群體擁有最多的單倍型（9個），QP群體單倍型最少（2個）。核苷酸多樣性均較低（0.00 311～0.00 732<0.05），其中MG群體稍高（0.00 732），QP群體最低（0.00 311），總體為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性。

由表3可知，5個群體的變異來源主要為群體內(nèi)部變異（93.93%），少量來自群體間（6.07%）。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，個體間遺傳距離均不超過0.05，且多數(shù)接近0.00;除GW與QP群體的個體聚集外，其他群體間均有不同程度個體混合。由圖3可知，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖也顯示出了相同的趨勢，單倍型間并沒有依據(jù)地理位置而聚集，而是通過Hap 2、Hap 4和Hap 12，替換數(shù)個堿基后相連接，多數(shù)單倍型為群體內(nèi)部獨有。

3 討論

遺傳多樣性是生物適應(yīng)與進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富的遺傳多樣性使得物種能夠更好地適應(yīng)環(huán)境，擁有巨大的進(jìn)化潛力。人工養(yǎng)殖的動物，常因親本基數(shù)不足，產(chǎn)生奠基者效應(yīng)，難以避免近交和遺傳漂變，使得遺傳多樣性迅速丟失[9]。本研究基于線粒體D-loop區(qū)序列分析了安徽省內(nèi)5個翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，150條 D-loop 序列共檢出18個單倍型，65個變異位點，其中，包括18個簡約信息位點與47個單堿基突變位點。D-loop區(qū)堿基組成呈現(xiàn)明顯的（A+T，63.1%）堿基偏倚，符合脊椎動物線粒體堿基構(gòu)成的一般特征[10]。5個群體的遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)為較高的單倍型多樣性（Hd，mean=0.596）與較低的核苷酸多樣性（Pi，mean=0.005 3）的模式。與野生鱖相比，養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性與核苷酸多樣性都有較多的流失。比如，程起群等同樣使用線粒體D-loop 區(qū)作為分子標(biāo)記，對長江流域的大眼鱖（Sinipercak nerii）進(jìn)行了遺傳多樣性調(diào)查，結(jié)果顯示，Hd，mean=0.923，Pi，mean=0.009 5[11];成為為等使用微衛(wèi)星標(biāo)記，對3個野生翹嘴鱖群體和2個養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性調(diào)查，結(jié)果同樣表明野生群體的遺傳多樣性要高于養(yǎng)殖群體[12]。此外，這種模式暗示5個群體近期可能經(jīng)歷瓶頸事件，產(chǎn)生奠基者效應(yīng)，使得核苷酸多樣性在小群體中經(jīng)由遺傳漂變迅速丟失[13]。這一模式在其他物種的養(yǎng)殖群體中也有所報道，蘇雨等基于D-loop區(qū)分析了中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）養(yǎng)殖群體的的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，Hd，mean=0.931，Pi，mean=0.014 3;趙立祥等同樣采用D-loop區(qū)作為標(biāo)記，分析了寶石鱸（Scortum barcoo）養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示Hd，mean=0.274，Pi，mean=0.000 8。

遺傳多樣性的時空差異分布，造成了不同的群體結(jié)構(gòu)，對于群體結(jié)構(gòu)的了解，有助于更好地制定養(yǎng)殖模式與育種策略。遺傳分化指數(shù)FST是用來衡量群體分化程度的一個指標(biāo)，根據(jù)Wright的劃分標(biāo)準(zhǔn)可分為：0.00～0.05，無分化;>0.05～0.15，中度分化;>0.15～0.25，高度分化;>0.25，重度分化[14]。由表2和圖2可知，本研究的遺傳分化系數(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)群體間都發(fā)生了高度分化（FST mean=0.144），但是個體間遺傳距離卻均<0.05，并且多數(shù)接近0。一般認(rèn)為遺傳距離超過0.01時，就表明群體遺傳變異較大[15]。由表1可知，遺傳距離與遺傳分化指數(shù)間的矛盾，可用群體間單倍型多樣性與核苷酸多樣性的差異解釋，這是因為遺傳距離是以核苷酸差異為計算基礎(chǔ)，而遺傳分化指數(shù)是以基因型頻率為計算基礎(chǔ)。更進(jìn)一步，產(chǎn)生這一矛盾的根本原因可能是由于奠基者效應(yīng)使得核苷酸多樣性迅速丟失，而單倍型多樣性的保留在不同群體間產(chǎn)生了差異。同樣地，在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出了和系統(tǒng)進(jìn)化樹相似的結(jié)果，5個群體的單倍型并沒有依照地理位置聚集，反而以3個主要共享單倍型Hap 2、Hap 4、Hap 12為中心，其余單倍型通過數(shù)個堿基的替換演變成群體內(nèi)部獨有單倍型。A-MOVA分析顯示，5個群體間的變異來源主要是群體內(nèi)部（93.93%），少數(shù)來自群體間（6.07%）。

綜上所述，本研究基于能夠反映種群間遺傳多樣性的線粒體D-loop區(qū)為分子標(biāo)記，分析了5個安徽省翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，5個群體的遺傳多樣性較低，可能發(fā)生過瓶頸事件;群體結(jié)構(gòu)發(fā)生了中等程度的分化，產(chǎn)生了各個群體內(nèi)部獨有的單倍型，但是群體間遺傳距離較小，不足以認(rèn)定為群體間有差異。因此，在后續(xù)的繁殖與選育工作中，應(yīng)當(dāng)加強對遺傳背景的篩查，避免因遺傳背景的相似，使得育種工作得不到有效實施。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡玉婷，段國慶，凌 俊，等. 金色鱖魚選育群體與野生群體的遺傳變異分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（20）：197-200.

[2]曾慶凱，孫成飛，董浚鍵，等. 翹嘴鱖3個不同群體的遺傳多樣性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（8）：3241-3250.

[3]顏元杰，曹哲明，丁煒東，等. 江蘇省6個翹嘴鱖群體的遺傳多樣性分析[J]. 海洋漁業(yè)，2019，41（1）：25-33.

[4]Taanman J W. The mitochondrial genome：structure，transcription，translation and replication[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1999，1410（2）：103-123.

[5]Galtier N，Nabholz B，Glémin S，et al. Mitochondrial DNA as a marker of molecular diversity：a reappraisal[J]. Molecular Ecology，2009，18（22）：4541-4550.

[6]Kumar S，Stecher G，Li M，et al. MEGA X：molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution，2018，35（6）：1547-1549.

[7]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，2009，25（11）：1451-1452.

[8]Leigh J W，Bryant D. Popart：full‐feature software for haplotype network construction[J]. Methods in Ecology and Evolution，2015，6（9）：1110-1116.

[9]Ventura M，Petrusek A，Miró A，et al. Local and regional founder effects in lake zooplankton persist after thousands of years despite high dispersal potential[J]. Molecular Ecology，2014，23（5）：1014-1027.

[10]Satoh T P，Miya M，Mabuchi K，et al. Structure and variation of the mitochondrial genome of fishes[J]. BMC Genomics，2016，17（1）：719.

[11]程起群，呂 浩，逄嬌慧，等. 長江流域4個野生大眼鱖群體的遺傳多樣性分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2019，26（4）：774-782.

[12]成為為，夏儒龍，王青云，等. 不同野生群體與家系養(yǎng)殖翹嘴鱖遺傳多樣性分析[J]. 淡水漁業(yè)，2020，50（2）：31-37.

[13]Grant，W，Bowen，et al. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of Marine fishes：insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity，1998，89（5）：415-426.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Bulletin of Mathematical Biology，1990，52（1/2）：241-295.

[15]Lan H，Shi L. The origin and genetic differentiation of native breeds of pigs in southwest China：an approach from mitochondrial DNA polymorphism[J]. Biochemical Genetics，1993，31（1/2）：51-60.