楊俊芳 曹越 王宙 王亞 張宏斌 趙宜婷 王宏偉

摘要：為了篩選最佳構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜的親本組合，以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1分別為母本，基于全基因組重測(cè)序（WGS）技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對(duì)2組親本進(jìn)行SNP標(biāo)記多態(tài)性分析。結(jié)果表明，2組親本間多態(tài)性標(biāo)記均比較豐富，其中以HCH1為母本的組合2的親本多態(tài)性更佳，SNP多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個(gè)，可用aa×bb型SNP標(biāo)記為181 791個(gè)。最佳親本組合的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜、多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蓖麻;全基因組重測(cè)序;親本;SNP;多態(tài)性分析

中圖分類號(hào)：S563.903.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）09-0053-05

蓖麻（Ricinus communis L.，2n=20），屬于大戟科的單型蓖麻屬[1]，是雌雄同株異花植物，正常株蓖麻花序軸上方為紅色雌花，下方為黃色雄花，圓錐花序，常異花授粉，多級(jí)分枝，無(wú)限花期。蓖麻是一種重要的能源油料作物，因其蓖麻油具有的特殊物理性質(zhì)，被應(yīng)用于航空、航天、軍工、工程塑料、化工、紡織等數(shù)十個(gè)行業(yè)[2]。但是受困于蓖麻傳統(tǒng)育種的局限性，在選擇具有理想性狀的植株，特別是多基因控制性狀時(shí)，需要很長(zhǎng)時(shí)間且缺乏精確性，蓖麻品種改良進(jìn)程緩慢。分子標(biāo)記輔助育種（MAS）方法可以有效地解決這些問(wèn)題。遺傳圖譜和數(shù)量性狀定位（QTL）已成為多種植物分子標(biāo)記輔助育種的重要工具[3-8]。

在蓖麻上關(guān)于遺傳圖譜構(gòu)建的研究起步較晚，研究者也較少。國(guó)內(nèi)學(xué)者畢川等最早開始蓖麻圖譜構(gòu)建工作[9]，2016年構(gòu)建了第1張相對(duì)完整的遺傳圖譜[10]，共331個(gè)標(biāo)記（317個(gè)SSR、7個(gè)SRAP標(biāo)記、3個(gè)SSRAP標(biāo)記、3個(gè)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、1個(gè)ISSR標(biāo)記）分布在10個(gè)連鎖群上，覆蓋 1 164.73 cM 基因組，平均標(biāo)記間隔為3.63 cM。2019年又新構(gòu)建了1張SSR標(biāo)記遺傳圖譜并對(duì)蓖麻雌性復(fù)雜性狀進(jìn)行了定位[11]。2016年Tomar等通過(guò)遺傳群體篩選出 141 個(gè)（RAPD、 ISSR、SSR）標(biāo)記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，找到了關(guān)于蓖麻抗枯萎病的2個(gè) QTLs[12]。2017年Tomar等篩選出 336 個(gè)（RAPD、ISSR、SSR） 標(biāo)記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并定位到了與蓖麻木炭腐病相關(guān)的新型QTLs[13]。2019年Yu等基于GBS測(cè)序技術(shù)對(duì)200個(gè)重組自交系（RIL）群體進(jìn)行測(cè)序分析，構(gòu)建了10個(gè)連鎖群（LGs）的高分辨率遺傳圖譜包含8 896個(gè)高質(zhì)量的SNPs，覆蓋1 852.33 cM基因組，篩選到了16個(gè)控制種子大小和質(zhì)量的QTLs[14]。

近年來(lái)，隨著第2代測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展和測(cè)序成本的降低，高通量測(cè)序技術(shù)為植物基因型鑒定和遺傳作圖帶來(lái)了方法上跨越式的突破[15]。以SNP 標(biāo)記為代表的新一代分子標(biāo)記大批量地用于植物高密度遺傳圖譜的構(gòu)建[16-19]。傳統(tǒng)的SSR、RAPD、AFLP、RFLP等分子標(biāo)記上圖量少，標(biāo)記間遺傳距離較大、基因組覆蓋率低，而SNP標(biāo)記的上圖量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)分子標(biāo)記，圖譜分辨率高、定位精度高。蓖麻全基因組測(cè)序完成于2010年，形成了蓖麻的第1張基因草圖，基因組大小約350 M，組裝水平為Scaffold，Scaffolds有25 763條[20]。蓖麻測(cè)序工作的完成為開展蓖麻基因組水平的研究奠定了基礎(chǔ)，但是由于蓖麻基因組組裝水平并未到染色體，而且Scaffolds也比較多，組裝水平還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于很多作物。據(jù)此可以借助構(gòu)建高密度遺傳圖譜的方法，對(duì)蓖麻的多種農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位，挖掘相關(guān)基因，加快蓖麻分子標(biāo)記輔助育種的進(jìn)程。而且高密度的遺傳圖譜可以輔助基因組組裝，提高全基因組精細(xì)圖譜完整性。

本研究以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1為母本分別構(gòu)建F1、F2、BC1群體。基于全基因組重測(cè)序（WGS）技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對(duì)2組親本進(jìn)行SNP標(biāo)記多態(tài)性分析，以便篩選出最佳組合，為構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜奠定良好的基礎(chǔ)，進(jìn)而對(duì)蓖麻多種農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位和基因挖掘。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH1和HCH3為母本，2017年分別雜交收獲F1，2018年F1自交收獲F2、與母本回交收獲BC1。父本SL1為綠稈、密刺、中稈、早熟、花籽的正常兩性株，且雄花比例極大，單株主穗甚至無(wú)雌花，僅在分枝穗上有少量雌花。母本1：HCH3為紅稈、無(wú)刺、高稈、晚熟、小黑籽有極少量鑲嵌雄花雌性系。母本2：HCH1為紅稈、密刺、高稈、晚熟、小黑籽有少量鑲嵌雄花的雌性系。2019年5月將3個(gè)親本材料、F2及回交BC1群體種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）經(jīng)濟(jì)作物研究所，正常田間管理。

1.2 基因組DNA提取及測(cè)序

用剪刀取幼嫩蓖麻葉片0.1～0.5 g，用植物基因組DNA提取試劑盒（Solar Bio）提取每個(gè)樣品的基因組DNA。利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀（Eppendorf公司，德國(guó)）檢測(cè)DNA濃度及純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。按照高通量測(cè)序的要求，每樣品的DNA總量≥1 μg，濃度≥50 ng/μL;樣品純度D260 nm/280 nm為1.8～2.0，D260 nm/230 nm為1.9～2.4。電泳結(jié)果主帶清晰，無(wú)降解，可用于高通量測(cè)序。檢驗(yàn)合格的DNA樣品寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行建庫(kù)，并利用illumina HiSeqTM PE150進(jìn)行測(cè)序。

1.3 信息分析方法

原始測(cè)序數(shù)據(jù)基于Raw data進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除掉包含接頭信息、低質(zhì)量堿基、未測(cè)出的堿基（以N表示）等干擾信息，最終得到有效數(shù)據(jù)，即Clean data 或 Clean reads。經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾后的有效測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò) BWA 軟件（參數(shù)：mem-t4-k32-M）比對(duì)到蓖麻參考基因組（蓖麻全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TIGR，http：//castorbean.jcvi.org/downloads.php），比對(duì)結(jié)果經(jīng) SAMTOOLS 去除重復(fù)（參數(shù)：rmdup）。采用GATK等軟件進(jìn)行群體SNP的檢測(cè)。

1.4 親本間標(biāo)記開發(fā)

基于蓖麻親本基因型檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行親本間多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)。過(guò)濾掉親本信息缺失的位點(diǎn)，篩選父母本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)，并從中篩選出符合F2群體作圖標(biāo)記類型的位點(diǎn)。用于F2群體作圖的標(biāo)記類型為aa×bb型，篩選父母本都為純合且親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)，即在某個(gè)SNP位點(diǎn)親本1基因型為GG，親本2基因型為AA，親本基因型都為純合，且親本間基因型不相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估

對(duì)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)控過(guò)后的親本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1），可以看出母本2的堿基數(shù)最大，達(dá)到了947×109 bp。父本次之，為8.64×109 bp。母本1的堿基數(shù)最少，為8.58×109 bp。3個(gè)親本的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)量均達(dá)到了99.8%以上，測(cè)序錯(cuò)誤率同為004%，Q20、Q30、GC含量也達(dá)到了測(cè)序要求。最終獲得了高質(zhì)量的Clean data，能夠順利進(jìn)行下一步的比對(duì)工作。

2.2 Reads與參考基因組比對(duì)情況

蓖麻參考基因組大小為 336 968 299 bp。3個(gè)親本的比對(duì)率在98%以上，對(duì)參考基因組（排除N區(qū)）的平均覆蓋深度在20X以上，1X覆蓋深度（至少有1個(gè)堿基覆蓋）95.73%及以上，4X覆蓋深度（至少有4個(gè)堿基覆蓋）在92.35%及以上。親本比對(duì)結(jié)果正常（表2），可用于后續(xù)的變異檢測(cè)及多態(tài)性分析。

2.3 親本SNP檢測(cè)結(jié)果

將比對(duì)到蓖麻基因組上的reads挑選出來(lái)，采用 GATK對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行群體SNP的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)得到的SNP相關(guān)信息。父本和母本2的SNP標(biāo)記總數(shù)和純合標(biāo)記數(shù)量均高于母本1。親本SNP檢測(cè)結(jié)果見表3。

2.4 標(biāo)記多態(tài)性分析

以父本SL1和母本HCH3（母本1）為雜交組合1構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個(gè)，可用aa×bb型標(biāo)記為171 829個(gè)（表4）。以父本SL1和母本HCH1（母本2）為雜交組合2構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個(gè)，可用aa×bb型標(biāo)記為181 791個(gè)（表5）。通過(guò)2個(gè)雜交組合間不同類型標(biāo)記數(shù)量比較，可見由父本SL1和母本HCH1（母本2）搭配的組合2的總標(biāo)記數(shù)和可用型標(biāo)記數(shù)都較優(yōu)。這與田間觀察到的表型性狀分離情況也一致，組合2構(gòu)建的F2群體、BC1群體分離的多樣性比組合1更豐富。同時(shí)，通過(guò)表4和表5明顯看出aa×bb型標(biāo)記并不是最多的標(biāo)記，hk×hk類型標(biāo)記最多，超過(guò)25萬(wàn)個(gè)，在組合1中同樣存在類似的問(wèn)題。由于hkxhk與nnxnp、lmxll型標(biāo)記均適用于由雜合親本構(gòu)建的F1作圖群體。而本試驗(yàn)的親本均為純合，且構(gòu)建的為F2作圖群體，故同一組合間不同標(biāo)記數(shù)量的比較沒(méi)有太大的參考價(jià)值，本試驗(yàn)僅對(duì)不同組合間的同一aa×bb型標(biāo)記進(jìn)行比較分析。

3 討論與結(jié)論

在構(gòu)建遺傳圖譜前首先要確定親本組合，若親本材料選取不當(dāng)， 會(huì)直接影響圖譜的質(zhì)量以及準(zhǔn)確性[21]。傳統(tǒng)遺傳圖譜構(gòu)建親本組合的確定，需經(jīng)過(guò)分子標(biāo)記多態(tài)性篩選[22-25]，高密度遺傳圖譜構(gòu)建親本的選擇同樣也需要進(jìn)行標(biāo)記多態(tài)性分析。

2018年花生上基于WGS技術(shù)對(duì)2個(gè)親本及91個(gè)RIL群體進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標(biāo)記數(shù)為97 571個(gè)，可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為18 252個(gè)，最終上圖標(biāo)記數(shù)為8 869個(gè)，覆蓋3 120 cM基因組，平均遺傳距離1.45 cM[26]。2018年大豆上基于SLAF測(cè)序技術(shù)對(duì)親本和149株RILs個(gè)體進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標(biāo)記數(shù)為391 476個(gè)，可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為53 132個(gè)，最終上圖標(biāo)記數(shù)為5 111個(gè)，覆蓋 2 909.46 cM 基因組，平均遺傳距離0.57 cM[27]。2019年在胡蘿卜上基于WGS技術(shù)對(duì)2個(gè)親本及137個(gè)F2群體進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建了超高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為411 891個(gè)，最終上圖標(biāo)記為378 738個(gè)，覆蓋1 306.8 cM基因組，平均遺傳距離0.46 cM[28]。2020年在煙草上基于WGS技術(shù)構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為1 626 811個(gè)，最終上圖標(biāo)記為 45 081 個(gè)，遺傳距離為3 486.78 cM，平均遺傳距離0.495 cM[29]。本研究中獲得的組合1親本間多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個(gè)，可用多態(tài)性標(biāo)記為 171 829 個(gè);組合2親本間多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為 581 158 個(gè)，可用多態(tài)性標(biāo)記為181 791個(gè)。最終的上圖標(biāo)記量還需要經(jīng)過(guò)對(duì)F2群體多態(tài)性標(biāo)記分析，之后再過(guò)濾掉一部分缺失的、偏分離的標(biāo)記才能確定。但是目前來(lái)看，通過(guò)2組親本間的可用多態(tài)性標(biāo)記分析，進(jìn)一步對(duì)2個(gè)組合子代F2群體進(jìn)行重測(cè)序均是可行的。相比較而言，組合2優(yōu)于組合1。

在群體構(gòu)建親本選擇恰當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上，通過(guò)高通量測(cè)序獲得的SNP標(biāo)記構(gòu)建的圖譜質(zhì)量一般要遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)標(biāo)記圖譜。然而通過(guò)選擇不同的測(cè)序技術(shù)、測(cè)序群體種類和大小獲得的圖譜質(zhì)量會(huì)有很大差異。測(cè)序方法上常用到的有全基因組測(cè)序和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)根據(jù)文庫(kù)構(gòu)建的不同原理又分為RAD、GBS、2b-RAD、ddRAD、SLAF測(cè)序技術(shù)[30]。理論上同一群體利用全基因組測(cè)序比簡(jiǎn)化基因組測(cè)序獲得的圖譜質(zhì)量更高。但全基因測(cè)序的方法在成本上比簡(jiǎn)化基因組測(cè)序要高很多，因此簡(jiǎn)化基因組測(cè)序要比全基因組測(cè)序應(yīng)用得更多。近年來(lái)玉米[31]、大豆[32]、花生[33]、芝麻[34]、紅豆[35]、向日葵[36]、甜瓜[37]等多種作物均有用簡(jiǎn)化測(cè)序技術(shù)的研究成果。蓖麻基因組相對(duì)于其他作物較小，在測(cè)序成本方面利用全基因組測(cè)序技術(shù)相比其他作物更具有優(yōu)勢(shì)。

本研究通過(guò)對(duì)3個(gè)親本的全基因重測(cè)序及親本間的標(biāo)記多態(tài)性分析表明，2組親本間多態(tài)性標(biāo)記都比較豐富，均可用來(lái)作為構(gòu)建高密度遺傳圖譜的親本。組合1親本多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個(gè)，可用aa×bb型標(biāo)記為171 829個(gè)。組合2親本多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個(gè)，可用aa×bb型標(biāo)記181 791。經(jīng)比較確定了以SL1為父本和HCH1為母本的組合2為最佳親本組合。最佳親本的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜及進(jìn)行多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Alexandrov O S，Karlov G I. Molecular cytogenetic analysis and genomic organization of major DNA repeats in castor bean （Ricinus communis L.）[J]. Molecular Genetics and Genomics，2016，291（2）：775-787.

[2]楊俊芳，王 亞，曹 越，等. 蓖麻性別決定基因研究進(jìn)展[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（7）：1164-1167.

[3]Wheeler N，Sederoff R. Role of genomics in the potential restoration of the American chestnut[J]. Tree Genetics & Genomes，2008，5（1）：181.

[4]Wu J，Li L T，Li M，et al. High-density genetic linkage map construction and identification of fruit-related QTLs in pear using SNP and SSR markers[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（20）：5771-5781.

[5]Chen J，Wang N，F(xiàn)ang L C，et al. Construction of a high-density genetic map and QTLs mapping for sugars and acids in grape berries[J]. BMC Plant Biology，2015，15：28.

[6]Ren X，Wang J，Liu L，et al. SNP-based high density genetic map and mapping of btwd1 dwarfing gene in barley[J]. Scientific Reports，2016，6：31741.

[7]Jiang N，Shi S，Shi H，et al. Mapping QTL for seed germinability under low temperature using a new high-density genetic map of rice[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：1223.

[8]Zhao Y，Su K，Wang G，et al. High-density genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping for hawthorn （Crataegus pinnatifida Bunge）[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：5492.

[9]畢 川，陸建農(nóng)，殷學(xué)貴. 蓖麻遺傳圖譜構(gòu)建初報(bào)[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，28（5）：532-535，564.

[10]Liu S，Yin X E，Lu J N，et al. The first genetic linkage map of Ricinus communis L. based on genome-SSR markers[J]. Industrial Crops and Products，2016，89：103-108.

[11]Lu J N，Shi Y Z，Yin X E，et al. The genetic mechanism of sex type，a complex quantitative trait，in Ricinus communis L.[J]. Industrial Crops and Products，2019，128：590-598.

[12]Tomar R S，Parakhia M V，Thakkar J R，et al. Development of linkage map and identification of QTLs responsible for fusarium wilt resistance in castor （Ricinus communis L.）[J]. Research Journal of Biotechnology，2016，11（5）：67-73.

[13]Tomar R S，Parakhia M V，Rathod V M，et al. Molecular mapping and identification of QTLs responsible for charcoal rot resistance in castor （Ricinus communis L.）[J]. Industrial Crops and Products，2017，95：184-190.

[14]Yu A，Li F，Xu W，et al. Application of a high-resolution genetic map for chromosome-scale genome assembly and fine QTLs mapping of seed size and weight traits in castor bean[J]. Scientific Reports，2019，9（1）：11950.

[15]賴國(guó)榮，張 靜，劉 函，等. 基于GBS構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL定位[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，25（9）：1400-1410.

[16]唐立群，肖層林，王偉平. SNP分子標(biāo)記的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（12）：154-158

[17]Li B，Lu X，Dou J，et al. Construction of a high-density genetic map and mapping of fruit traits in watermelon （Citrullus lanatus L.） based on whole-genome resequencing[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（10）：3268.

[18]Jiang J，F(xiàn)an X，Zhang Y，et al. Construction of a high-density genetic map and mapping of firmness in grapes （Vitis vinifera L.） based on whole-genome resequencing[J]. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（3）：797.

[19]Talukder Z，Underwood W，Ma G，et al. Genetic dissection of phomopsis stem canker resistance in cultivated sunflower using high density SNP linkage map[J]. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1497.

[20]Chan A P，Crabtree J，Zhao Q，et al. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis[J]. Nature Biotechnology，2010，28（9）：951-956.

[21]鄭 劍，李興星，蘇華英，等. 粳稻資源熱粳35遺傳圖譜構(gòu)建與耐熱QTL分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，31（5）：844-851.

[22]單紅麗，李文鳳，黃應(yīng)昆，等. 甘蔗抗褐銹病基因定位親本間多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，33（11）：2119-2125.

[23]許夢(mèng)琦，李雙鈴，任 艷，等. 花生作圖親本間分子標(biāo)記的多態(tài)性分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（11）：2763-2766.

[24]黃煥煥，張桂華，韓毅科，等. 黃瓜作圖親本間分子標(biāo)記的多態(tài)性分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（2）：47-49.

[25]賀 丹，吳芳芳，張佼蕊，等. 牡丹轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其分子標(biāo)記開發(fā)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（6）：1428-1433.

[26]Agarwal G，Clevenger J，Pandey M K，et al. High-density genetic map using whole-genome resequencing for fine mapping and candidate gene discovery for disease resistance in peanut[J]. Plant Biotechnology Journal，2018，16（11）：1954-1967.

[27]Zhang Y，Li W，Lin Y，et al. Construction of a high-density genetic map and mapping of QTLs for soybean （Glycine max） agronomic and seed quality traits by specific length amplified fragment sequencing[J]. BMC Genomics，2018，19（1）：641.

[28]Luo X，Xu L，Wang Y，et al. An ultra-high-density genetic map provides insights into genome synteny，recombination landscape and taproot skin colour in radish （Raphanus sativus L.）[J]. Plant Biotechnology Journal，2020，18（1）：274-286.

[29]Tong Z，Zhou J，Xiu Z，et al. Construction of a high-density genetic map with whole genome sequencing in Nicotiana tabacum L.[J]. Genomics，2020，112（2）：2028-2033.

[30]魏慶鎮(zhèn). 黃瓜果實(shí)長(zhǎng)度性狀QTL定位及候選基因的篩選[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)2016：19-20

[31]Wu X，F(xiàn)eng F，Zhu Y，et al. Construction of high-density genetic map and identification of QTLs associated with seed vigor after exposure to artificial aging conditions in sweet corn using SLAF-seq[J]. Genes，2019，11（1）：37.

[32]Liu D L，Chen S W，Liu X C，et al. Genetic map construction and QTL analysis of leaf-related traits in soybean under monoculture and relay intercropping[J]. Scientific Reports，2019，9（1）：2716.

[33]Zhang S，Hu X，Miao H，et al. QTL identification for seed weight and size based on a high-density SLAF-seq genetic map in peanut （Arachis hypogaea L.）[J]. BMC Plant Biology，2019，19（1）：537.

[34]Du H，Zhang H，Wei L，et al. A high-density genetic map constructed using specific length amplified fragment （SLAF） sequencing and QTL mapping of seed-related traits in sesame （Sesamum indicum L.）[J]. BMC Plant Biology，2019，19（1）：588.

[35]Li Y，Yang K，Yang W，et al. Identification of QTL and qualitative trait loci for agronomic traits using SNP markers in the adzuki bean[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：840.

[36]Zhou F，Liu Y，Liang C，et al. Construction of a high-density genetic linkage map and QTL mapping of oleic acid content and three agronomic traits in sunflower （Helianthus annuus L.） using specific-locus amplified fragment sequencing （SLAF-seq）[J]. Breeding Science，2018，68（5）：596-605.

[37]Oren E，Tzuri G，Dafna A，et al. High-density NGS-based map construction and genetic dissection of fruit shape and rind netting in Cucumis melo[J]. Theoretical and Applied Genetics，2020，133（6）：1927-1945.