李 萍 高麗華 任 衛(wèi)

（大連市第三人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，大連 116033）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)壓痛和滑膜關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性全身自身免疫疾病，可導(dǎo)致嚴重殘疾，其發(fā)病率為0.5%～1.0%。通過嚴密的監(jiān)測和控制，快速診斷和治療的方法，可以增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者緩解的可能性[1-3]。miRNA 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)中的治療潛力已得到很多研究的認可[4-5]。最近，miR-199a 被鑒定為高度保守的miRNA，可在多種細胞類型中調(diào)節(jié)多種生長行為。miR-199a-3p 在各種細胞中始終顯示出抗增殖，抗侵襲，抗炎和促凋亡的作用[6]。以往研究證實，miR-199a-3p 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中表達下調(diào)，且部分通過靶向RB1 抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[7]。但是miR-199a 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的功能機制尚未完全清楚。半胱氨酸甘氨酸富含蛋白2（cysteine and glycine-rich protein 2，CSRP2）僅富含半胱氨酸LIM 家族成員，并且包含2 個LIM 域，在各種組織中廣泛表達。有研究表明，CSRP2 有助于肌動蛋白骨架的組裝和/或維持，抑制血管平滑肌細胞遷移，且在多種腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]。然而，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用尚不清楚。本課題組前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-199a 和CSRP2 存在特異性結(jié)合位點，提示miR-199a 可能靶向CSRP2 參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。因此，本研究旨在探索miR-199a 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、侵襲和炎癥因子分泌的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞MH7A 購自美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）；RT-qPCR 試劑盒購自上海碧云天生物研究所；Transwell 小室購自美國BD Bioscience 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自北京康為世紀；雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自上海宇玫博生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

MH7A 細胞在37℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，所使用的培養(yǎng)液為DMEM 培養(yǎng)基混有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素。

將正常培養(yǎng)的MH7A細胞標(biāo)記為對照組；將用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（100 mg/L）處理48 h的MH7A細胞，標(biāo)記為LPS組；用3倍質(zhì)粒量的脂質(zhì)體混合質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染LPS組MH7A細胞 5 h，在添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染的效率如何，確認轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)研究。具體的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒如下：LPS+miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、LPS+miR-199a組（轉(zhuǎn)染miR-199a mimics）、LPS+miR-199a+pcDNA3.1組（共轉(zhuǎn)染miR-199a mimics和pcDNA3.1）、LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2組（共轉(zhuǎn)染miR-199a mimics和pcDNA3.1-CSRP2）。

1.3 RT-qPCR 檢測細胞中miR-199a、CSRP2 的表達

收集各組MH7A 細胞，提取細胞中的總RNA，并轉(zhuǎn)錄成為cDNA，用RT-qPCR 試劑盒檢測cDNA中miR-199a、CSRP2 的表達。miR-199a 上游引物序 列 為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGTAACCAAT-3'，下游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGACAGTAGTCTGCA CAT-3'；CSRP2 上游引物序列為5'-GATCCTCGAG ATGCCTGTCTGGGGAGGTGG-3'，下游引物序列為5'-GATCAGGATCCCGCTGGGCATGAACAAG AGCCC-3'；U6 上游引物序列為5'-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3'，下游引物序列為5'-GG AACGCTTCACGAATTTG-3'；β-actin 上游引物序列為5'-CGTCTTCCCCTCCA TCGT-3'，下游引物序列為5'-GCCTCGTCGCCC ACATAG-3'。以U6、β-actin 為內(nèi)參，2-△△Ct法計算miR-199a、CSRP2的相對表達水平。

1.4 CCK-8 法檢測細胞增殖

取對數(shù)期的MH7A 細胞接種到96 孔板中，接種密度為5×104個，48 h 后分別向各組每孔細胞中添加CCK-8 試劑10 μL，孵育箱反應(yīng)2 h，使用全自動酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處光密度（OD）值。

1.5 免疫印跡檢測細胞中CSRP2、p21、E-cadherin蛋白水平

收集各組MH7A 細胞，充分裂解提取總蛋白，并變性。將變性后的蛋白離心取上清進行SDSPAGE 蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，然后進行2.5%脫脂奶粉封閉處理2 h。將膜分別用一抗CSRP2（1∶1 000）、p21（1∶1 500）、E-cadherin（1∶2 000）處理24 h（4℃），再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000）處理2 h（37℃）。用ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯影曝光。以目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為相對蛋白表達量。

1.6 Transwell 法檢測細胞侵襲

各組MH7A 細胞先用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，再取約200 μL 的細胞平鋪在小室上表面，取600 μL 含血清的培養(yǎng)基置于小室的下室，37℃培養(yǎng)12 h。輕輕取出小室，緩緩擦去上表面多余的細胞，用甲醛固定膜上發(fā)生穿孔的細胞，再用結(jié)晶染色。最后將膜進行固定、封片。在顯微鏡下觀察細胞，計數(shù)，取平均值。

1.7 ELISA 檢測白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量

各組MH7A 細胞按照IL-6 檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒的要求進行處理，并按照說明書要求操作，檢測IL-6、TNF-α 的含量。

1.8 雙熒光素酶報告實驗檢測細胞的熒光活性

根據(jù)mircode（http://mircode.org/）預(yù)測的CSRP2 結(jié)合核苷酸序列設(shè)計含有CSRP2 結(jié)合位點的基因片段（WT-CSRP2）和突變的CSRP2 核苷酸序列（MUT-CSRP2），將其克隆至熒光載體psiCHECK2，構(gòu)建熒光素酶報告基因。將其與miR-NC、miR-199a 共轉(zhuǎn)染至MH7A 細胞。最后按照雙熒光素酶報告實驗試劑盒要求，檢測細胞的螢火蟲熒光素酶活性，再檢測海腎熒光素酶的熒光活性，結(jié)果計算以海腎熒光素酶的活性為內(nèi)參，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶的活性的比值表示細胞的熒光活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用±s表示，多組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-199a對MHTA miR-199a、p21、E-cadherin表達和細胞活性及侵襲的影響

與對照組相比，LPS 組細胞中miR-199a 表達顯著降低，p21 和E-cadherin 蛋白表達均顯著降低，細胞的OD 值顯著升高，侵襲細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）（圖1、表1）。提示過表達miR-199a 后能夠明顯減弱LPS 對細胞的上述調(diào)控。

表1 過表達miR-199a 對MHTA miR-199a、p21、E-cadherin 表達和細胞活性及侵襲的影響（n=9，±s）

表1 過表達miR-199a 對MHTA miR-199a、p21、E-cadherin 表達和細胞活性及侵襲的影響（n=9，±s）

*P＜0.05 vs 對照組； #P＜0.05 vs LPS 組、LPS+miR-NC 組

組別 miR-199a p21 E-cadherin OD 值 侵襲細胞數(shù)對照組 0.98±0.05 0.29±0.03 0.35±0.03 0.51±0.03 99.00±7.15 LPS 組 0.26±0.02* 0.13±0.02* 0.17±0.02* 1.24±0.05* 231.00±9.34*LPS+miR-NC 組 0.27±0.02 0.12±0.02 0.15±0.02 1.25±0.05 230.00±9.28 LPS+miR-199a 組 0.72±0.04# 0.25±0.02# 0.30±0.03# 0.78±0.04# 136.00±7.59#

圖1 各組細胞p21、E-cadherin 蛋白的表達

2.2 過表達miR-199a 對MHTA 炎癥因子表達的影響

與對照組相比，LPS 組細胞中IL-6、TNF-α 表達量均顯著升高（P＜0.05），提示過表達miR-199a可明顯降低IL-6、TNF-α 的表達量（表2）。

表2 過表達miR-199a 對MHTA 細胞中炎癥因子表達的影響（n=9，±s，ng/L）

表2 過表達miR-199a 對MHTA 細胞中炎癥因子表達的影響（n=9，±s，ng/L）

*P＜0.05 vs 對照組； #P＜0.05 vs LPS 和 LPS+LPS+miR-NC

組別 IL-6 TNF-α對照組 93.16±6.12 23.67±1.08 LPS 組 368.28±9.15* 91.12±3.04*LPS+miR-NC 組 367.56±9.12 91.04±3.01 LPS+miR-199a 組 149.18±7.55# 38.24±2.03#

2.3 miR-199a 靶向CSRP2

通過在線預(yù)測網(wǎng)站mircode（http://mircode.org/）預(yù)測到miR-199a 與CSRP2 之間存在互補的核苷酸序列（圖2）。雙熒光素酶實驗顯示，miR-199a 明顯抑制WT-CSRP2 細胞的熒光活性，顯著下調(diào)CSRP2 mRNA 的表達（表3）。

圖2 miR-199a 靶向CSRP2

表3 miR-199a 調(diào)控CSRP2 的表達（n=9，±s）

表3 miR-199a 調(diào)控CSRP2 的表達（n=9，±s）

*P＜0.05 vs miR-NC 組

組別 WT-CSRP2 MUT-CSRP2 CSRP2 mRNA miR-NC 組 0.98±0.05 1.00±0.05 1.00±0.04 miR-199a 組 0.24±0.03* 1.02±0.06 0.28±0.03*

2.4 過表達CSRP2 對MHTA 細胞活性和侵襲的影響

與LPS+miR-199a+pcDNA3.1 組相比，LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2組細胞CSRP2蛋白表達顯著升高，p21、E-cadherin 蛋白表達顯著降低，細胞的OD 值顯著升高，侵襲細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）（圖3，表4），提示過表達CSRP2 能減弱miR-199a 對MHTA 細胞活性和侵襲的影響。

表4 過表達CSRP2 對MHTA 細胞活性和侵襲及CSRP2、p21、E-cadherin 表達的影響（n=9，±s）

表4 過表達CSRP2 對MHTA 細胞活性和侵襲及CSRP2、p21、E-cadherin 表達的影響（n=9，±s）

*P＜0.05 vs LPS+miR-199a+pcDNA3.1 組

組別 OD 值 侵襲細胞數(shù) CSRP2 p21 E-cadherin LPS+miR-199a+pcDNA3.1 組 0.77±0.04 137±7.61 0.31±0.03 0.26±0.02 0.31±0.03 LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2 組 1.12±0.06* 208±8.82* 0.78±0.05* 0.14±0.01* 0.19±0.02*

圖3 各組細胞CSRP2、p21、E-cadherin 蛋白的表達

2.5 過表達CSRP2 對MHTA 細胞炎癥因子表達的影響

與LPS+miR-199a+pcDNA3.1組相比，LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2組細胞IL-6、TNF-α的含量均顯著升高（P＜0.05）（表5），提示過表達CSRP2能增強miR-199a對MHTA細胞炎癥因子表達的影響。

表5 過表達CSRP2 對MHTA 細胞炎癥因子表達的影響（n=9，±s，ng/L）

表5 過表達CSRP2 對MHTA 細胞炎癥因子表達的影響（n=9，±s，ng/L）

*P＜0.05 vs LPS+miR-199a+pcDNA3.1

組別 IL-6 TNF-α LPS+miR-199a+pcDNA3.1 組 148.98±7.53 38.19±2.04 LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2 組310.52±8.84* 79.23±3.68*

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，可引起關(guān)節(jié)和身體其他部位的慢性炎癥，其病因尚不清楚[9]。研究顯示，成纖維樣滑膜細胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[10]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞直接參與滑膜增生和使局部炎癥永久化細胞因子的產(chǎn)生，還有助于調(diào)節(jié)免疫細胞和蛋白水解破壞細胞外基質(zhì)、軟骨和骨骼[11]。靶向類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞已被公認為是一種新穎的治療方法，具有潛在改善臨床結(jié)果并且對全身免疫的影響較小[12]。最近，miR-199a已被證明參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎性調(diào)控過程[13]。Wu 等[14]研究顯示，過表達miR-199a-5p 可逆轉(zhuǎn)促炎性脂肪因子內(nèi)臟脂肪素水平升高誘導(dǎo)IL-6 和TNF-α 產(chǎn)生增加。Wangyang 等[15]報道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中miR-199a-3p 表達顯著降低，過表達miR-199a-3p 可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。本研究采用LPS處理類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞以模擬其在體內(nèi)的環(huán)境，結(jié)果顯示，miR-199a 在LPS 誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中表達異常降低，這說明miR-199a 與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的細胞表型變化具有緊密的相關(guān)性。且LPS 誘導(dǎo)的MH7A 細胞的增殖和侵襲能力均顯著升高，細胞中炎性因子IL-6、TNF-α 的表達上調(diào)，而過表達miR-199a 能夠顯著減弱LPS 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的損害作用，推測miR-199a 具有潛在的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的價值，這與前人的研究結(jié)果[14-15]均相一致。

本研究結(jié)果還表明，miR-199a 可靶向CSRP2，這可能也是miR-199a 發(fā)揮功能的機制之一。CSRP2 是CSRP 基因家族成員之一，編碼一組LIM域蛋白，參與發(fā)育和細胞分化相關(guān)調(diào)控過程，與白血病的惡化過程有關(guān)[16-17]。Céline 等[18]報道，CSRP2 在缺氧條件下的乳腺癌細胞和腫瘤標(biāo)本中發(fā)生上調(diào)，CSRP2 敲低顯著抑制了缺氧刺激的MDA-MB-231 細胞中侵襲性偽足的形成，細胞外基質(zhì)降解和侵襲，而CSRP2 過表達可以增強缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子1α 耗盡細胞的侵襲能力，提示CSRP2 可通過促進侵襲性偽足的形成，進而促進缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲。本研究結(jié)果顯示，CSRP2 為miR-199a 的靶標(biāo)之一，過表達CSRP2后能夠明顯影響miR-199a 對LPS 誘導(dǎo) 的MH7A 細胞增殖、侵襲和炎性因子分泌的調(diào)控。這也說明CSRP2 能夠恢復(fù)miR-199a 在LPS 誘導(dǎo)MH7A 細胞中的調(diào)控作用。

綜上所述，miR-199a 可抑制LPS 誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖、侵襲和致炎因子的分泌，其機制可能與靶向CSRP2 有關(guān)，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的方向。