李哲宏，呂家興，甘新天，白磊鵬，曹海營(yíng)，金 宇*

（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北承德 067000； 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科）

白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）主要是由激活的Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞和噬堿性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子構(gòu)成，對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能產(chǎn)生廣泛的作用[1]。IL-4具有抑制細(xì)胞免疫、增強(qiáng)體液免疫、促進(jìn)特異性以及非特異性免疫的殺傷功能，該細(xì)胞因子及其受體已被證實(shí)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用[2,3]。CD34分子是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于人類及其他哺乳動(dòng)物造血干祖細(xì)胞表面，并隨細(xì)胞的成熟逐漸減少至消失[4]。目前，越來(lái)越多的研究表明，CD34與腫瘤的增殖密切相關(guān)，CD34是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞最敏感的標(biāo)記物，檢測(cè)CD34的表達(dá)可反映腫瘤組織微血管密度情況，從而定量地反映腫瘤微血管增生情況，其表達(dá)水平一定程度上反映腫瘤細(xì)胞的增殖水平[5]。VX2細(xì)胞是由Shope病毒感染形成的兔乳頭狀瘤，經(jīng)過(guò)72次移植傳代，建立的穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系。VX2細(xì)胞是上皮組織惡性腫瘤，可接種于多個(gè)部位建立原位腫瘤動(dòng)物模型，具有生長(zhǎng)迅速、腫瘤局部侵襲快，遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)[6]。在兔VX2骨腫瘤模型建模早期，VX2細(xì)胞可以破壞骨組織微環(huán)境，使腫瘤發(fā)生局部浸潤(rùn)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7,8]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用VX2腫瘤建立兔脛骨骨腫瘤模型，利用Elisa法檢測(cè)術(shù)前及植瘤后7d、14d脛骨骨髓內(nèi)CD34和IL-4變化與表達(dá)水平的關(guān)系，探究在腫瘤增殖移過(guò)程中，兔VX2骨腫瘤模型髓內(nèi)的免疫功能及腫瘤增殖水平的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

日本大耳白兔(簡(jiǎn)稱家兔)30只，3個(gè)月齡，體重2.0～2.5 kg，雄性，購(gòu)自北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0007]，飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物房。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)：LL047)。VX2腫瘤細(xì)胞株（購(gòu)自重慶蒙博生物科技有限公司），于本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔子IL-4酶聯(lián)免疫分析試劑盒、兔子CD34酶聯(lián)免疫分析試劑盒（購(gòu)自河北瑞帕特生物科技有限公司）、由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院金宇團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)的通道內(nèi)置式骨腫瘤穿刺裝置(專利號(hào)：ZL201416055578.0)。

1.3 腫瘤組織的制備

從液氮中取出凍存的VX2瘤株進(jìn)行復(fù)蘇，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/ml，將制備好的0.5ml腫瘤細(xì)胞懸液接種于一只家兔左大腿肌肉處，制成傳代荷瘤兔。2～3周后，待瘤體增大至約2cm×2cm×3cm時(shí)，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）麻醉。嚴(yán)格無(wú)菌條件下，外科手術(shù)分離皮下組織、完整剝離腫瘤。將腫瘤完整取出后移至無(wú)菌工作臺(tái)上，置于37℃的PBS中清洗3遍，去除腫瘤中血跡、壞死組織和纖維組織，使用眼科剪將腫瘤剪成1mm×1mm×1mm大小的組織塊備用。

1.4 骨腫瘤模型的制作

30只日本大耳白兔按隨機(jī)數(shù)法分成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組各15只。兩組家兔均術(shù)前6h禁食水，經(jīng)左耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）麻醉。左后肢備皮仰臥位固定于操作臺(tái)上，遵守外科無(wú)菌操作原則。選取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚作一1cm長(zhǎng)切口，逐層切開(kāi)皮下組織和筋膜，暴露髕韌帶，縱行鈍性分離髕韌帶，顯露脛骨平臺(tái)，在脛骨平臺(tái)面用1mm克氏針鉆孔，抽取1ml骨髓留存。實(shí)驗(yàn)組家兔用頂棒將體積為1mm3的VX2腫瘤組織塊沿套管推入脛骨髓腔內(nèi)，拔出套管，骨蠟封堵骨孔，無(wú)水乙醇擦拭骨孔周圍，兩側(cè)髕韌帶縫合重建后，逐層縫合切口，模型制作完成，術(shù)后每只實(shí)驗(yàn)兔連續(xù)3d予青霉素80萬(wàn)單位/d，肌肉注射，每日1次，以預(yù)防感染。對(duì)照組家兔在脛骨平臺(tái)使用1mm克氏針鉆孔，抽取1ml骨髓流程，骨蠟封堵，但不植入VX2腫瘤組織。

1.5 標(biāo)本的采集

建模后第7天，對(duì)每只家兔均使用通道內(nèi)置式骨腫瘤封閉活檢裝置進(jìn)行活檢，將穿刺針?lè)湃胄吞?hào)適合的通道套管內(nèi)，在左側(cè)脛近端穿入，取病理部位，注射器抽取1ml骨髓留存后，將通道套管留在穿刺部位，由通道尾側(cè)安裝尾帽，并將通道旋入固定于骨孔，從而達(dá)到封閉穿刺入路的目的植入內(nèi)置穿刺通道。建模第14天，打開(kāi)封閉通道再次取樣后，耳緣靜脈栓塞處死全部家兔，取脛骨組織行組織病理學(xué)檢查。

1.6 組織HE染色

脛骨骨質(zhì)、骨髓組織，行固定、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE染色），鏡下觀察VX2骨腫瘤在骨髓組織中7d（附圖A），14d（附圖B）的表現(xiàn)和對(duì)照組家兔骨髓組織的表現(xiàn)（附圖C）。

附圖 兔骨髓組織HE染色

1.7 ELISA實(shí)驗(yàn)

將采集的標(biāo)本每0.5ml分裝留存于含枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，于無(wú)菌操作臺(tái)上移入離心管，采用4000r/min離心5min，收集上清液，一份采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）測(cè)試上清液中的IL-4、CD34含量，測(cè)試過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，另一份留存?zhèn)溆谩?/p>

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用方差分析。顯著性差異水平設(shè)定為P＜0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 病理檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組植瘤第7天穿刺活檢組織，可見(jiàn)VX2腫瘤細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，核分裂象多見(jiàn)，為核大深染的腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞，植瘤第14天發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞緊密排列呈巢狀，纖維間隔少，細(xì)胞異型性大。對(duì)照組兔骨髓組織病理檢查結(jié)果顯示正常骨髓組織。

3.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組兔髓內(nèi)IL-4、CD34含量與建模前相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、表2：

表1 兩組荷瘤兔骨髓IL-4水平比較（ng/L）

表2 兩組荷瘤兔骨髓CD34水平比較（ng/L）

4 討論

腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移受到多基因多蛋白的影響，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，如何早期發(fā)現(xiàn)與早期抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤研究工作的困境之一[9]。骨與軟組織肉瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)細(xì)胞起源的腫瘤，約占所有成人惡性腫瘤的1%[10]，于早期就發(fā)生局部浸潤(rùn)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。目前，手術(shù)干預(yù)一直是骨和軟組織肉瘤治療的主要手段，同時(shí)輔以放射治療以達(dá)到局部控制。雖然細(xì)胞毒性化療使得骨與軟組織肉瘤的治療方式產(chǎn)生了革命性的優(yōu)化，但是經(jīng)典的治療方案產(chǎn)生的副作用仍無(wú)法避免，且其療效預(yù)后也無(wú)法得到明顯的改善，其最主要的原因同骨與軟組織肉瘤浸潤(rùn)密切相關(guān)[12,13]。因此，使用精準(zhǔn)骨腫瘤動(dòng)物模型可以更進(jìn)一步了解骨腫瘤的發(fā)生發(fā)展方式和其對(duì)骨組織微環(huán)境的影響，對(duì)臨床研究具有重要意義。本研究經(jīng)脛骨移植VX2腫瘤組織塊建立兔脛骨骨腫瘤模型，觀察到在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤的增殖導(dǎo)致了骨組織微環(huán)境的改變。

IL-4是Th2細(xì)胞分泌的最典型的細(xì)胞因子，一定程度反映了Th2細(xì)胞的表達(dá)水平,在腫瘤生物學(xué)中對(duì)各種髓系來(lái)源群體起到了良好的調(diào)節(jié)作用[1,14]。IL-4分化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞顯著增加腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞上IL-4受體的過(guò)表達(dá)可以為腫瘤治療提供靶點(diǎn)[2,15]。實(shí)驗(yàn)顯示，建立VX2兔骨腫瘤模型后，IL-4腫瘤增殖標(biāo)記物在植瘤后14d內(nèi)表達(dá)水平不斷增高。IL-4增高的原因可能是，隨著腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，VX2瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-4，而IL-4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2型極化，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，最終改變骨組織微環(huán)境。CD34分子為高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，分子量在105～120kD[16]，選擇性地表達(dá)于人類造血干祖細(xì)胞、間質(zhì)前體細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞表面，并隨細(xì)胞的成熟逐漸源弱至消失[4]。CD34分子反映腫瘤的惡性程度，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)CD34腫瘤增殖標(biāo)記物在植瘤后表達(dá)水平不斷增高，其原因可能與腫瘤增殖生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系。CD34與腫瘤組織微血管密度的情況有關(guān)，其在VX2腫瘤組織上高表達(dá)，而正常成熟的骨髓組織中低表達(dá)或者不表達(dá)的特點(diǎn)，可反映腫瘤的增殖程度。

本實(shí)驗(yàn)采用的通道內(nèi)置式骨腫瘤組織取出裝置是根據(jù)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院金宇團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)的穿刺活檢器械及密封栓取出裝置的一種改良裝置，避免活檢過(guò)程中腫瘤組織與正常組織接觸的同時(shí)，在活檢結(jié)束后通過(guò)尾帽封堵穿刺孔，防止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，內(nèi)置通道和封堵尾帽可長(zhǎng)期留置體內(nèi)，是一種有效的物理封堵技術(shù)[18]。

本研究顯示，通過(guò)檢測(cè)并觀察骨髓組織中IL-4與CD34水平的變化，可以了解骨組織微環(huán)境的狀態(tài)，以預(yù)測(cè)骨腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移程度，評(píng)價(jià)骨腫瘤的惡性程度。同時(shí)，對(duì)自主設(shè)計(jì)的通道內(nèi)置式骨腫瘤取出裝置的應(yīng)用性評(píng)價(jià)進(jìn)行了動(dòng)物測(cè)試，是一種有效的物理封堵技術(shù)。