文/游宇

為了解福建大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病病原菌的耐藥情況，作者于2017年1月～2019年12月期間從福建省大黃魚(yú)主要養(yǎng)殖區(qū)寧德市發(fā)病或有明顯內(nèi)臟白點(diǎn)病癥狀的大黃魚(yú)體內(nèi)共分離獲得病原菌69株，均為假單胞菌，對(duì)其進(jìn)行8種水產(chǎn)用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明：69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)8種抗菌藥物敏感性表現(xiàn)不一，總體而言，其對(duì)硫酸新霉素、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星相對(duì)敏感；而對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶相對(duì)耐藥。

大黃魚(yú)是中國(guó)四大海產(chǎn)、八大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，福建省是大黃魚(yú)的主養(yǎng)區(qū)，其中寧德是大黃魚(yú)養(yǎng)殖中心。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，近年來(lái)，福建省大黃魚(yú)養(yǎng)殖年產(chǎn)量約為16×104t左右，占全國(guó)大黃魚(yú)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%左右，且產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。

隨著福建省大黃魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖集約化程度和養(yǎng)殖密度不斷攀升，水質(zhì)環(huán)境惡化、疾病暴發(fā)流行等問(wèn)題日益突出。其中，大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病是近年來(lái)養(yǎng)殖大黃魚(yú)的主要病害之一，在大黃魚(yú)各個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域均廣泛流行，一旦發(fā)病，累計(jì)死亡率可達(dá)50%，給大黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

經(jīng)多方研究確認(rèn)，大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病是一種細(xì)菌性疾病，其病原主要為假單胞菌。而抗菌藥物作為防治細(xì)菌性疾病的主要手段，可有效降低水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌性疾病的發(fā)生率和死亡率。但近年來(lái)，因?yàn)橐恢睙o(wú)法全面落實(shí)有針對(duì)性地科學(xué)用藥，導(dǎo)致疾病防治過(guò)程中表現(xiàn)出一些亂用、濫用藥物的現(xiàn)象，容易導(dǎo)致病原微生物耐藥性增強(qiáng)和藥物殘留超標(biāo)，不僅加劇了細(xì)菌性疾病的防治難度，而且可能帶來(lái)水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題。因此，開(kāi)展水生動(dòng)物病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)工作，了解其對(duì)常用抗菌藥物的敏感性變化規(guī)律，對(duì)評(píng)估水產(chǎn)品質(zhì)量安全及指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)、精準(zhǔn)、規(guī)范地使用抗菌藥物具有十分重要的意義。

為了解大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病病原菌的耐藥情況，本文對(duì)近三年福建省大黃魚(yú)源假單胞菌的耐藥性狀況進(jìn)行分析，以期為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶規(guī)范用藥提供一定的科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）病原菌來(lái)源

病原菌為2017年1月～2019年12月期間從福建省大黃魚(yú)主要養(yǎng)殖區(qū)寧德市發(fā)病或有明顯癥狀的大黃魚(yú)魚(yú)體上分離獲得，分離部位主要為患魚(yú)的肝臟、腎臟、脾臟等有大量肉眼可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)的內(nèi)臟，分離培養(yǎng)基采用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），（28±2）℃恒溫培養(yǎng)后選擇優(yōu)勢(shì)菌落純化后備用。試驗(yàn)期間共分離病原菌69株，均為假單胞菌。

（二）供試藥物

選用目前我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許使用的水產(chǎn)用抗菌類藥物：硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶。

（三）藥物耐藥性測(cè)定

參照《水生動(dòng)物致病菌藥敏實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程》，采用液體培養(yǎng)基稀釋法，按無(wú)菌操作規(guī)范要求，將供試藥物的初始濃度配制成200mg/L，再用胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基按2n倍比依次稀釋成11個(gè)濃度梯度，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組，后依次接入1:1體積的濃度為106cfu/mL的待測(cè)菌懸液，于（28±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每種供試藥物做兩個(gè)平行，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照組菌株生長(zhǎng)良好時(shí)，以肉眼觀察到能抑制菌株生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為其對(duì)大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC。根據(jù)MIC，統(tǒng)計(jì)各抗菌藥物對(duì)分離菌株的MIC50和MIC90。

二、結(jié)果

（一）病魚(yú)特征觀察

據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，在寧德地區(qū)，大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的流行時(shí)間為每年10月初至次年5月的低溫期，高發(fā)期在3月初至4月中下旬（水溫14℃～18℃），主要危害50g～150g的網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)。本文所分離到病原菌的樣品采集時(shí)間主要集中在每年的2月～5月份，患病大黃魚(yú)養(yǎng)殖期間出現(xiàn)自然消瘦、浮頭等現(xiàn)象，體表幾乎無(wú)明顯癥狀，個(gè)別魚(yú)體可見(jiàn)黏液增多現(xiàn)象，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟、脾臟等內(nèi)臟有0.5mm～3.0mm大小不等的白色結(jié)節(jié)（圖1）。

圖1 大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)?。ㄆc(diǎn)）

（二）福建大黃魚(yú)源假單胞菌耐藥性總體情況

檢測(cè)了69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)各抗菌藥物的敏感性，分布情況詳見(jiàn)表1～表4。從表中可看出，69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的敏感性表現(xiàn)不一。根據(jù)國(guó)家獸藥標(biāo)準(zhǔn)，總體上，福建大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)硫酸新霉素、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星相對(duì)敏感；其對(duì)硫酸新霉素的MIC主要集中在0.78mg/L～6.25mg/L，對(duì)恩諾沙星的MIC主要集中在0.39mg/L～1.56mg/L，對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星的MIC主要集中在3.13mg/L～6.25mg/L、0.20mg/L～0.39mg/L和最低測(cè)試濃度下限（≤0.10mg/L）等三個(gè)區(qū)間。而大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶相對(duì)耐藥；其對(duì)甲砜霉素的MIC值主要集中在25mg/L～50mg/L和最高測(cè)試濃度上限（≥100mg/L）兩個(gè)區(qū)間，對(duì)氟苯尼考的MIC值主要集中在25mg/L～50mg/L和最高測(cè)試濃度上限兩個(gè)區(qū)間，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶的MIC主要集中在25mg/L～50mg/L，對(duì)磺胺嘧啶的耐藥濃度均在最高測(cè)試濃度上限。從表1～表3可看出，2017年及2018年分離的大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)磺胺甲噁唑的耐藥濃度均在最高測(cè)試濃度上限，而2019年分離的大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)磺胺甲噁唑的MIC則主要集中在0.39mg/L～0.78mg/L，較往年變化巨大，由原來(lái)的相對(duì)耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)敏感。

表1 8種抗菌藥物對(duì)31株大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC值（2017年）

表2 8種抗菌藥物對(duì)13株大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC值（2018年）

表3 8種抗菌藥物對(duì)25株大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC值（2019年）

表4 8種抗菌藥物對(duì)69株大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC值（2017年～2019年）

（三）福建大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的年度變化

為比較不同年份大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥情況，按年份針對(duì)大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)各抗菌藥物的MIC50和MIC90進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5、圖2、圖3。從表5可以看出，不同年份分離的菌株對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、磺胺嘧啶的MIC50和MIC90差異較小。與2017年分離菌株相比，2019年分離菌株對(duì)硫酸新霉素和鹽酸環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90均略有增加，以及對(duì)磺胺間甲氧嘧啶的MIC50和MIC90有明顯上升，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)2019年大量使用了這三種抗菌藥物有關(guān)。與2017年分離菌株相比，2019年分離菌株對(duì)甲砜霉素的MIC50和MIC90有明顯下降趨勢(shì)，而對(duì)磺胺甲噁唑的MIC50和MIC90呈現(xiàn)大幅度下降趨勢(shì)，這可能是由于近年來(lái)寧德地區(qū)大黃魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)未使用或科學(xué)合理使用磺胺甲噁唑，耐藥濃度的大幅度下降可能與菌株耐藥性的自然消失有關(guān)，但該藥物敏感性的準(zhǔn)確性情況還有待持續(xù)跟蹤檢測(cè)。

表5 69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的MIC50和MIC90

圖2 69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的MIC50的年度變化

圖3 69株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的MIC90的年度變化

三、分析與建議

從2017年～2019年大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)各測(cè)試抗菌藥物耐藥情況來(lái)看，所測(cè)試的8種抗菌藥物中，假單胞菌對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星敏感性最高，MIC50為0.44mg/L，其次是恩諾沙星和硫酸新霉素，其MIC50分別為0.602mg/L和1.71mg/L，因此，當(dāng)大黃魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生內(nèi)臟白點(diǎn)病時(shí)，建議可在執(zhí)業(yè)獸醫(yī)的指導(dǎo)下優(yōu)先選擇同屬氟喹諾酮類的鹽酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星，并結(jié)合藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)合理使用藥物。切忌一旦發(fā)現(xiàn)病魚(yú)就投放大量抗菌藥物，避免造成病原菌耐藥，增加水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治難度。還要通過(guò)宣傳不斷提高養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥及生態(tài)防控病害的意識(shí)，避免其濫用藥；鼓勵(lì)高校、科研院所等相關(guān)單位聯(lián)合開(kāi)發(fā)安全高效環(huán)境友好型綠色抗菌藥物替代品，如酶制劑、微生態(tài)制劑和中草藥制劑等，預(yù)防大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病。

磺胺嘧啶呈現(xiàn)較高的耐藥性，均在最高測(cè)試濃度上限（≥100mg/L），建議養(yǎng)殖戶停止使用該藥。甲砜霉素和氟苯尼考相對(duì)耐藥，之后對(duì)大黃魚(yú)源假單胞菌進(jìn)行耐藥性普查時(shí)，可適當(dāng)縮小藥物濃度梯度范圍，究其原因。這兩種藥物在使用過(guò)程中容易使病原菌短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較高的耐藥性，且其耐藥性消失速率較慢，兩種藥物還屬于劑量依賴型藥物，應(yīng)慎用。

本文大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病病魚(yú)樣品主要采自寧德市蕉城區(qū)和霞浦縣海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)，樣品來(lái)源有一定的局限性，而據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，不同養(yǎng)殖地區(qū)魚(yú)類病原菌的藥物敏感性存在地域性差異，因此還應(yīng)進(jìn)一步加大大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病病原菌的耐藥性普查，擴(kuò)大監(jiān)測(cè)區(qū)域和范圍，針對(duì)福建省不同地區(qū)的大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病建立藥物敏感譜，依據(jù)體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果確定敏感藥物的合理使用劑量，從而高效指導(dǎo)養(yǎng)殖戶精準(zhǔn)用藥、科學(xué)用藥，避免養(yǎng)殖戶盲目用藥破壞水域生態(tài)環(huán)境，給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)隱患。