高丙鵬，田 靜，靳銀山，劉亞?wèn)|，于時(shí)良，劉健男

(1.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院泌尿外科，貴州畢節(jié) 551700；2.畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)中醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

以腎結(jié)石和腎鈣質(zhì)沉著癥為代表的晶體相關(guān)腎損傷是常見(jiàn)的腎臟疾病，通常源于代謝失衡和集合系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)的異常[1-2]。其中與高草酸尿癥相關(guān)的草酸鈣結(jié)石是最常見(jiàn)的結(jié)石類型[3]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是草酸鈣結(jié)石腎損傷中的主要病理過(guò)程。草酸鈣結(jié)晶可以激活NLRP3炎癥體導(dǎo)致炎癥因子成熟并釋放，進(jìn)而引起局部微環(huán)境病變乃至腎功能損傷[4]。結(jié)石導(dǎo)致的活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成也可通過(guò)氧化應(yīng)激途徑促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化以及組織器官損傷[5]。因此具有抗炎抗氧化的藥物被廣泛用于防治腎結(jié)石形成及腎功能損傷[6]。

大黃素(Emodin)是傳統(tǒng)中藥大黃的主要成分，是一種蒽醌類衍生物(圖1A)，具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗纖維化及免疫調(diào)節(jié)的作用[7-9]。Emodin被證實(shí)可以通過(guò)NLRP3炎癥體途徑改善哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)[10]。但其針對(duì)草酸鈣結(jié)石腎損傷是否存在保護(hù)作用尚未得到證實(shí)。本研究從體外試驗(yàn)層面探究Emodin是否可以改善草酸鈣結(jié)晶引起的腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激與炎癥損傷，從而為Emodin等具有抗炎抗氧化作用的藥物在腎結(jié)石疾病中的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK2)購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。高糖DMEM合成液體培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，草酸(Na2C2O4)、氯化鈣(CaCl2·2H2O)、Emodin(美國(guó)Sigma公司)，兔抗人NLRP3單克隆抗體、兔抗人IL-18單克隆抗體、兔抗人IL-1β單克隆抗體(中國(guó)萬(wàn)類生物公司)，小鼠抗人ASC單克隆抗體、小鼠抗人cleaved-caspase-1單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(中國(guó)中杉金橋公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，活性氧檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司)，IL-18及IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Boster公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HK2細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)為1%的青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求分別給予草酸鈣結(jié)晶及Emodin干預(yù)。研究分為3組：對(duì)照組、草酸鈣干預(yù)組、草酸鈣+Emodin干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用10 μmol/L Emodin預(yù)處理2 h后，再用0.5 mmol/L的草酸鈣結(jié)晶處理24 h[11]。

1.3 草酸鈣結(jié)晶的制備將10 mmol/L的草酸和10 mmol/L的氯化鈣溶解在去離子水中并混合使其濃度為5 mmol/L。使用HCl和NaOH將混合物調(diào)節(jié)至生理pH值7.4，在室溫下沉降24 h后以2 000 g的離心力離心5 min。獲得的草酸鈣晶體用甲醇洗滌并室溫干燥，收集后使用紫外線滅菌以備用[12]。

1.4 免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后的細(xì)胞提取總蛋白并采用蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白濃度，用12.5 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h。然后孵育NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、IL-18及IL-1β抗體并4 ℃冰箱過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后滴加電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)液進(jìn)行顯影。Image Lab軟件分析蛋白條帶的灰度值后進(jìn)一步用內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化并分析目的蛋白的表達(dá)差異。

1.5 細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活性使用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。HK2細(xì)胞在96孔板內(nèi)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，約7 000個(gè)/孔。在0.5 mmol/L草酸鈣結(jié)晶及相應(yīng)濃度的Emodin處理24 h后(每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔)，每個(gè)孔加入10 μL CCK-8溶液并37 ℃孵育1 h。于波長(zhǎng)450 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.6 ROS檢測(cè)干預(yù)后的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液洗去殘余藥物后，在含DCFH-DA探針的無(wú)血清培養(yǎng)液中重懸，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，期間每隔3～5 min混勻吹打1次。每組均取相同數(shù)目的細(xì)胞重懸于500 μL的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中。濾過(guò)并轉(zhuǎn)移至流式BD管后，搖勻并上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果采用流式分析軟件FlowJo進(jìn)行分析。

1.7 培養(yǎng)液IL-18及IL-1β水平的測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液提取后離心(離心力1 000 g，10 min)。取上清液用ELISA法對(duì)炎癥因子IL-18、IL-1β濃度進(jìn)行測(cè)定，于波長(zhǎng)410 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算炎癥因子濃度。

2 結(jié) 果

2.1 Emodin對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷的改善CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示草酸鈣結(jié)晶能明顯降低細(xì)胞活性(圖1B)。Emodin的預(yù)處理可以改善草酸鈣結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明濃度為10 μmol/L的Emodin對(duì)腎小管上皮細(xì)胞在草酸鈣結(jié)晶損傷中的保護(hù)效果最佳，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇此濃度為干預(yù)條件。

2.2 Emodin對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2)，草酸鈣結(jié)晶的干預(yù)會(huì)使腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS發(fā)生率顯著增加。與對(duì)照組相比，草酸鈣結(jié)晶組ROS的生成增加了4～5倍。而與草酸鈣結(jié)晶單獨(dú)干預(yù)組相比，Emodin的加入顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.3 Emodin對(duì)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的緩解Western blot顯示與對(duì)照組相比(圖3)，草酸鈣結(jié)晶干預(yù)顯著增加了細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體組成蛋白(NLRP3、ASC、Pro-caspase-1)及下游相關(guān)炎癥因子(Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β)的表達(dá)。而Emodin預(yù)處理可以顯著下調(diào)該NLRP3炎癥體通路相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β)的表達(dá)。

A：Emodin結(jié)構(gòu)式；B：細(xì)胞增殖與毒性試驗(yàn)。圖1 Emodin結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖與毒性試驗(yàn)圖

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組ROS表達(dá)量；B：柱狀圖定量分析。組間對(duì)比，**P<0.01。圖2 不同治療組ROS表達(dá)量分析圖

A：Western blot檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β的表達(dá)量；B：蛋白表達(dá)量的柱狀圖定量分析。與對(duì)照組比較，##P<0.01;與草酸鈣組比較，**P<0.01。圖3 Emodin對(duì)草酸鈣結(jié)晶引起的炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 Emodin對(duì)細(xì)胞分泌炎癥因子的影響ELISA檢測(cè)顯示(圖4)，草酸鈣結(jié)晶干預(yù)增加細(xì)胞培養(yǎng)基中炎癥因子IL-18及IL-1β的含量。與對(duì)照組相比，草酸鈣結(jié)晶組的培養(yǎng)液中IL-18/IL-1β濃度升高2～3倍，而Emodin的預(yù)處理可以顯著緩解該分泌炎癥因子的升高，各組間差異顯著，P<0.01。

與對(duì)照組比較，##P<0.01;與草酸鈣組比較，**P<0.01。圖4 Emodin對(duì)各組細(xì)胞分泌炎癥因子水平的影響

3 討 論

解除解剖梗阻以及在飲食上限制草酸的攝入一直以來(lái)都是腎結(jié)石的主要治療方案。然而，研究表明慢性腎結(jié)石及腎鈣質(zhì)沉著癥會(huì)造成腎功能嚴(yán)重?fù)p傷，由此我們意識(shí)到在腎結(jié)石中保護(hù)腎功能十分重要[13]。腎結(jié)石的腎功能損傷主要來(lái)源于局部的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[5]。NLRP3炎癥體通路及氧化應(yīng)激已被證實(shí)參與草酸鈣結(jié)石的病理生理過(guò)程[5,14]，因此有必要尋找有效的抗炎抗氧化途徑治療草酸鈣結(jié)石導(dǎo)致的腎損傷。

ROS作為氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)被證明是結(jié)石病理?yè)p傷中的主要參與者[15]。相關(guān)研究表明ROS水平升高會(huì)引起腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，組織的炎癥反應(yīng)以及腎功能損傷[16]。也有研究表明ROS可以通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)NLRP3、pro-IL-18/1β等炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)NLRP3炎癥體通路并引起炎癥反應(yīng)[17]。我們的研究也表明草酸鈣結(jié)晶的干預(yù)會(huì)引起ROS上調(diào)，而Emodin預(yù)處理可以顯著緩解該氧化應(yīng)激損傷并保護(hù)細(xì)胞活性。

NLRP3炎癥體通路在草酸鈣結(jié)石腎損傷中的作用已經(jīng)在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)：草酸鈣結(jié)晶可以通過(guò)刺激NLRP3炎癥體分泌IL-1β導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷[18]；同時(shí)NLRP3炎癥體通路是高草酸尿癥大鼠腎功能衰竭的重要病理途徑[5]。我們也在體外實(shí)驗(yàn)角度證明了這一點(diǎn)，草酸鈣結(jié)晶的干預(yù)顯著上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白的表達(dá)及IL-18、IL-1β炎癥因子的分泌，同時(shí)該炎癥反應(yīng)可被Emodin顯著改善。NLRP3炎癥體的觸發(fā)包括啟動(dòng)和激活2個(gè)連續(xù)但功能獨(dú)立的步驟，其中炎癥體的啟動(dòng)觸發(fā)炎癥體組成蛋白NLRP3、ASC、Pro-caspase-1的合成，炎癥體的激活觸發(fā)NLRP3炎癥體的組裝與活化及下游炎癥因子的激活[19]。研究表明，ROS是參與這2個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵因子[19]。我們的結(jié)果亦與之相符，即在草酸鈣結(jié)晶和Emodin干預(yù)模型中，ROS與NLRP3炎癥體通路是被同向調(diào)節(jié)的。然而在草酸鈣結(jié)晶腎損傷中NLRP3炎癥體通路是否由ROS直接調(diào)控尚需進(jìn)一步探索。

Emodin作為傳統(tǒng)中藥大黃根莖的有效成分，具有廣泛的藥理作用，被應(yīng)用于抗癌、保肝、抗菌、抗炎及抗氧化領(lǐng)域[7]。其分子作用機(jī)制也從多角度進(jìn)行了闡述，如：Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路，IRS2/PI3K/Akt通路，NLRP3炎癥體通路[20-22]。然而，關(guān)于Emodin在草酸鈣結(jié)晶炎癥損傷及氧化應(yīng)激損傷中的作用尚無(wú)研究。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首次論證了Emodin在該領(lǐng)域的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，與Emodin在其他領(lǐng)域中的報(bào)道一致，我們發(fā)現(xiàn)Emodin可以顯著改善草酸鈣結(jié)晶引起的腎小管上皮細(xì)胞毒性、ROS生成和炎癥因子的表達(dá)。該結(jié)果證明Emodin可以通過(guò)調(diào)控ROS及NLRP3炎癥體通路改善草酸鈣結(jié)晶引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷。然而，Emodin在腎結(jié)石體內(nèi)模型的保護(hù)效果及具體作用靶點(diǎn)有待研究。

綜上所述，本研究首次從細(xì)胞層面驗(yàn)證了Emodin可以通過(guò)調(diào)控ROS及NLRP3炎癥體通路抑制草酸鈣結(jié)晶引起的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷。為草酸鈣腎結(jié)石的防治、Emodin及類似藥物的臨床應(yīng)用提供了新的研究方向與思路。