王新亮 彭玲 王健 賈晶晶 唐立平
摘要:?為了解蘋果Dof轉(zhuǎn)錄因子家族的生物學(xué)信息與功能,利用蘋果基因組GDDH13 v1.1檢索及RNA-seq轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)找到51個(gè)Dof 基因,并通過(guò) Pfam 和SMART檢測(cè)確認(rèn),進(jìn)一步對(duì)這些Dof基因進(jìn)行全面分析。結(jié)果表明,除MD07G1265700外,其他50個(gè)Dof蛋白均含有一個(gè)明顯的Dof結(jié)構(gòu)域,且有一個(gè)CX2CX21CX2C基序。這些Dof基因編碼氨基酸數(shù)為163~523,相對(duì)分子質(zhì)量為18 210~55 800,等電點(diǎn)為5.01~10.30,多數(shù)Dof成員定位于細(xì)胞核中, 少數(shù)定位于葉綠體或線粒體中。組織特異表達(dá)顯示多數(shù)Dof 基因在營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量高于生殖器官,而MD01G1084700、MD07G1153300、MD08G1040100、MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表達(dá)量最高。鹽堿脅迫下,除MD05G1023800基因沒有檢測(cè)到表達(dá)外,其他Dof基因的表達(dá)均受鹽堿脅迫影響,只是響應(yīng)強(qiáng)度和時(shí)間有差異,基因表達(dá)顯著上調(diào)的有7個(gè),顯著下調(diào)的有15個(gè)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示蘋果Dof轉(zhuǎn)錄因子生物功能奠定了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:?蘋果;Dof基因;轉(zhuǎn)錄因子;表達(dá)分析;生物信息學(xué)
中圖分類號(hào):?S661.1??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:?A??文章編號(hào):?1000-4440(2021)02-0480-13
Abstract:?In order to understand the biological information and function of apple Dof transcription factor family, 51 Dof genes were found by searching apple genome GDDH13 v1.1 and RNA-seq transcripts reconstruction, and they were confirmed as members of Dof transcription factor family by Pfam and SMART detection. The Dof genes were generally analyzed furtherly. The results showed that, besides MD07G1265700, the other 50 Dof proteins all contained an obvious Dof domain and a CX2CX21CX2C motif. The number of amino acids encoded by Dof gene ranged from 163 to 523, and the relative molecular weight ranged from 18 210 to 55 800, while the isoelectric point ranged from 5.01 to 10.30. Most of the Dof proteins were located in the nucleus, and a few of them were located in the chloroplast or mitochondria. The results of tissue-specific expression showed that the expression level of most of the Dof genes expressed in vegetative organs were higher than in reproductive organs, while the expression levels of MD01G1084700, MD07G1153300, MD08G1040100 and MD15G1034500 were the highest in immature fruit flesh. Under saline-alkali stress, except for MD05G1023800 gene, the expression of other Dof genes were affected by saline-alkali stress, but the intensity and time of response were different. There were seven Dof genes significantly up-regulated and 15 Dof genes significantly down regulated. The research results lay a theoretical foundation for further study on the biological function of Dof transcription factor in apple.
Key words:?apple;Dof gene;transcription factor;expression analysis;bioinformatics
蘋果(Malus pumila Mill.)是薔薇科中重要的果樹之一,與其他果樹相比,具有種植面積大、貨架期長(zhǎng)等特點(diǎn),蘋果在中國(guó)的種植面積和產(chǎn)量均為世界首位。土壤鹽堿、干旱、倒春寒等非生物脅迫制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。
Dof (DNA binding with one finger)蛋白是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[2],其N端含有一個(gè)由50~52個(gè)氨基酸組成的高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)——Dof結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域中含有1個(gè)高度保守的CX2CX21CX2C基序。Dof蛋白既能與特定的DNA序列結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá),也能與某些蛋白質(zhì)相互作用,參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控[3-5]。Dof蛋白識(shí)別的核心序列是5′-AAAG-3′或5′-CTTT-3′[6];其C端氨基酸序列變異性較大,是Dof蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域[7]。在單子葉植物和雙子葉植物均發(fā)現(xiàn)了許多Dof蛋白。目前,在小麥、大豆、水稻和擬南芥的基因組中,分別有31、78、30 和 36個(gè)Dof基因被發(fā)現(xiàn)[8-10]。植物中存在如此多的Dof基因說(shuō)明其參與植物多種復(fù)雜的生理功能控制。
本研究利用蘋果基因組,通過(guò)Dof結(jié)構(gòu)域序列檢索和RNA-seq轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),篩選并鑒定出51 個(gè)蘋果Dof基因家族成員,全面分析了它們編碼的Dof轉(zhuǎn)錄因子的Dof結(jié)構(gòu)域、保守基序、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹及其特異性表達(dá)。以期為進(jìn)一步研究Dof基因在調(diào)控蘋果生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)等過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。
1?材料與方法
1.1?試驗(yàn)材料與處理
平邑甜茶種子用0.2% KMnO4浸泡30 min,然后用流水沖洗干凈,與洗凈的細(xì)沙混勻置于4 ℃層積60 d。種子露白后播種在裝有種植土(細(xì)砂、蛭石、土的體積比為3∶2∶1 )的育苗盤中,并置于濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室苗圃中露天管理,每隔5 d澆1次 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH=6.8±0.2)。當(dāng)平邑甜茶苗長(zhǎng)到6片真葉時(shí),用加入了100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Na2SO4及50 mmol/L NaHCO3的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH=8)處理,在第0 d、1 d、3 d、6 d分別采集葉片和新根(每個(gè)樣品3次重復(fù))存放在液氮中備用。
1.2?RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
樣品總RNA用TRIzol試劑盒提取,利用磁珠富集mRNA,然后利用打斷Buffer將獲得的RNA片段化,使用隨機(jī)N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成,再合成cDNA第二條鏈。通過(guò)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熱變性使PCR產(chǎn)物形成單鏈,再利用橋式引物將單鏈DNA環(huán)化最終得到單鏈環(huán)狀DNA文庫(kù)。使用BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序,所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)純化去除低質(zhì)量、接頭及未知堿基N含量過(guò)高的read后得到可靠的高質(zhì)量序列,使用HISAT將所得序列比對(duì)到參考基因組序列(Malus x domestica GDDH13 Whole Genome v1.1,https://www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_GDDH13_v1.1)[11]。
1.3?GDDH13Dof轉(zhuǎn)錄因子篩選與鑒定
利用Dof結(jié)構(gòu)域序列,在蘋果基因組GDDH13 v1.1 mRNA進(jìn)行BLAST序列比對(duì)并搜索“Dof”關(guān)鍵詞篩選蘋果Dof候選基因。利用StringTie (http://ccb.jhu.edu/software/stringtie) 對(duì)平邑甜茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),然后用Cuffmerge (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks) 將所有樣品的重構(gòu)信息整合在一起,再使用Cuffcompare (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks) 將整合后的轉(zhuǎn)錄本與參考注釋信息比較,挑選出新轉(zhuǎn)錄本,然后使用CPC2 (http://cpc2.cbi.pku.edu.cn/)[12]預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白質(zhì)的潛力,然后將具有蛋白質(zhì)編碼潛力的新轉(zhuǎn)錄本加入?yún)⒖蓟蛑?,最后通過(guò)Pfam (http://pfam.xfam.org)[13] 和SMART (http://www.smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)鑒定出的Dof蛋白進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)ExPASy網(wǎng)站 (https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蘋果Dof蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析[14]。
1.4?Dof蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹、保守域和保守基序分析
從擬南芥信息數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR https://www.arabidopsis.org/ )下載獲得擬南芥的Dof轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列。利用MAFFT version 7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)比對(duì) Dof結(jié)構(gòu)域[15]。通過(guò)MAFFT online service和Evolview v3 (https://www.evolgenius.info//evolview/#mytrees//)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[15-16],用Average linkage (UPGMA)法構(gòu)建進(jìn)化樹,參數(shù)均為默認(rèn)值。利用GSDS2 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖[17]。利用MEME 5.1.1版本 (http://memesuite.org/tools/meme)分析Dof蛋白保守基序(數(shù)目設(shè)為15,寬度為6~50 aa)[18]。Dof蛋白亞細(xì)胞定位用在線軟件WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/) 預(yù)測(cè)。
1.5?Dof表達(dá)分析與功能注釋
從AppleMDO (http://bioinformatics.cau.edu.cn/AppleMDO/)網(wǎng)站的RNA-seq數(shù)據(jù)下載Dof 基因在7個(gè)不同組織(莖尖、葉片、莖、花、未成熟果肉、成熟果肉、成熟果皮)中的表達(dá)數(shù)據(jù)[19],利用Excel繪制表達(dá)熱圖。利用AppleMDO數(shù)據(jù)庫(kù)的GO analysis功能以GDDH13 v1.1 homology with Arabidopsis為參考進(jìn)行GO分析。
2?結(jié)果與分析
2.1?Dof基因的篩選與鑒定
利用Dof結(jié)構(gòu)域序列,在GDR數(shù)據(jù)庫(kù)蘋果基因組(Malus x domestica GDDH13 Whole Genome v1.1)[11]進(jìn)行BLAST序列比對(duì),篩選Dof 候選基因。并對(duì)平邑甜茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),挑選出新轉(zhuǎn)錄本,然后使用CPC2預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)編碼潛力,將新轉(zhuǎn)錄本中具有蛋白質(zhì)編碼潛力的添加到參考基因中。然后通過(guò)Pfam和SMART在線工具對(duì)篩選出的Dof蛋白進(jìn)行確認(rèn),共篩選鑒定出51個(gè)Dof家族成員。但是通過(guò)MAFFT version 7對(duì)這些Dof轉(zhuǎn)錄因子的Dof結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)只有50個(gè)基因具有典型的Dof結(jié)構(gòu)域(圖1),由圖1可以看出,有50個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子均含有1個(gè)明顯的高度保守的Dof結(jié)構(gòu)域,且結(jié)構(gòu)域內(nèi)均含有CX2CX21CX2C基序構(gòu)成的單鋅指結(jié)構(gòu)。而MD07G1265700雖然通過(guò)Pfam和SMART在線工具被鑒定為Dof家族成員,但是通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)其并不存在典型的CX2CX21CX2C單鋅指結(jié)構(gòu)。對(duì)Dof基因的定位,編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表1)。這些 Dof 基因在蘋果各個(gè)染色體上均有分布,它們編碼的蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為163~523 aa;相對(duì)分子質(zhì)量為18 210~55 800;等電點(diǎn)為5.01~10.30。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,除MD05G1023800、MD07G1265700、MD10G1280000可能定位于葉綠體中,MD05G1301100 可能定位于葉綠體或/和細(xì)胞核中,MD15G1275300可能定位于線粒體中,其他Dof蛋白均主要定位于細(xì)胞核中。
2.2?Dof家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹
利用鑒定的Dof蛋白與擬南芥的Dof蛋白氨基酸序列構(gòu)建了一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。 Dof蛋白分成11組。在這51個(gè)Dof蛋白中,8個(gè)分到A組,8個(gè)分到B組,2個(gè)分到C組,2個(gè)分到D組,6個(gè)分到E組,5個(gè)分到F組,4個(gè)分到G組,2個(gè)分到H組,9個(gè)分到I組,2個(gè)分到J組,3個(gè)分到K組。
2.3?Dof基因結(jié)構(gòu)分析
利用GDDH13 v1.1基因組注釋文件gene_models_20170612.gff3.gz繪制了Dof基因結(jié)構(gòu)圖(圖3)。圖3顯示,進(jìn)化樹分析中親緣關(guān)系近的基因,它們的基因結(jié)構(gòu)也相似。但是成員較多的A、B和I組中,基因結(jié)構(gòu)差異較大。
2.4?Dof蛋白保守motif分析
利用MEME在線軟件對(duì)Dof蛋白氨基酸序列進(jìn)行motif分析,可以看到Dof蛋白含有15個(gè)高度保守的motif,雖然它們的數(shù)目和位置差異較大,但是根據(jù)進(jìn)化樹分析,親緣關(guān)系近的Dof蛋白的motif數(shù)量和序列相似度較高(圖4)。其中50個(gè)Dof蛋白均含有1個(gè)保守的CX2CX21CX2C基序(含有motif 1或motif 13),而MD07G1265700 既不含有motif 1,也不含有motif 13。
2.5?Dof基因組織特異性表達(dá)
利用AppleMDO數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA-seq數(shù)據(jù),分析了Dof基因在莖尖、葉片、莖、花、未成熟果肉、成熟果肉和成熟果皮中的表達(dá)(圖5)。除MD12G1041000基因和MD14G1040400基因沒在任何組織中檢測(cè)到表達(dá)外,其他Dof 基因均至少在一個(gè)組織中檢測(cè)到表達(dá);這些Dof基因在莖、葉片、莖尖等營(yíng)養(yǎng)器官(組織)中的表達(dá)量大多高于在花、果肉、果皮等生殖器官(組織)中的表達(dá)量。而MD01G1084700、MD07G1153300、MD08G1040100、MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表達(dá)量最高,在成熟果肉中均未被檢測(cè)到。
2.6?平邑甜茶Dof基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)分析
近年來(lái),越來(lái)越多的研究結(jié)果表明Dof基因參與植物對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控。本研究利用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)了平邑甜茶在鹽堿脅迫0 d、1 d、3 d、6 d后葉片和根中Dof基因的表達(dá)情況(圖6)。在平邑甜茶中,除MD05G1023800基因沒有檢測(cè)到表達(dá)外,其他Dof基因均檢測(cè)到1次及以上的表達(dá),而且大多數(shù)Dof基因在根中的表達(dá)量顯著高于葉片。與對(duì)照(0 d)相比,在鹽堿脅迫下平邑甜茶根系中表達(dá)顯著上調(diào)的Dof基因有MD13G1070600、MD00G1125100、novelG001312、MD16G1071400、MD05G1318600、MD10G1297900、MD05G1018200基因。與對(duì)照(0 d)相比,表達(dá)顯著下調(diào)的基因有MD15G1309400、MD02G1161200、MD14G1040400、MD01G1041500、MD14G1216800、MD07G1265700、MD15G1034500、MD15G1275300、MD06G1194100、MD06G1173600、MD06G1205900、MD05G1312400、MD14G1180100、MD07G1057700、MD05G1301100基因。
2.7?功能注釋
利用AppleMDO數(shù)據(jù)庫(kù)的GO analysis功能對(duì)已有的50個(gè)Dof基因進(jìn)行了GO功能分析,結(jié)果顯示,共涉及到40個(gè)GO條目 (圖7),其中細(xì)胞組成 (CC) 9個(gè)、分子功能(MF) 3個(gè)、生物過(guò)程(BP) 28個(gè)。除分子功能中蛋白質(zhì)結(jié)合和生物過(guò)程中細(xì)胞組分組織、對(duì)非生物脅迫反應(yīng)、對(duì)刺激反應(yīng)等9個(gè)條目參與的基因較少,其余GO條目均有50個(gè)Dof基因參與。
3?結(jié)論與討論
Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育與響應(yīng)非生物脅迫中起著重要作用[20-22]。目前,Dof基因的報(bào)道主要集中在草本植物中[8-10],在木本植物中報(bào)道較少。本研究對(duì)GDDH13 v1.1基因組預(yù)測(cè)基因進(jìn)行了較全面的檢索,從已有基因中共檢索并鑒定了50個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子基因。另外通過(guò)對(duì)平邑甜茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),挑選出新轉(zhuǎn)錄本,然后使用CPC2對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼潛力預(yù)測(cè),然后通過(guò)Pfam和SMART在線工具鑒定出1個(gè)新的Dof基因,并命名為novelG001312。其中MD07G1265700雖然通過(guò)Pfam和SMART在線工具被鑒定為Dof轉(zhuǎn)錄因子家族成員,但是通過(guò)氨基酸序列比較和motif 分析發(fā)現(xiàn)其并不存在典型的CX2CX21CX2C單鋅指結(jié)構(gòu),說(shuō)明MD07G1265700可能不屬于Dof轉(zhuǎn)錄因子家族。
有研究結(jié)果表明:不同植物Dof蛋白的理論等電點(diǎn)基本處于5.41~6.97,且一般堿性氨基酸個(gè)數(shù)多于酸性氨基酸[23]。但本研究中蘋果Dof蛋白的等電點(diǎn)主要集中在5.01~10.30,多為堿性氨基酸,與小桐子和大豆Dof蛋白的等電點(diǎn)研究結(jié)果相似[24-25],說(shuō)明不同植物間Dof家族成員的等電點(diǎn)差異較大[26]。
系統(tǒng)進(jìn)化樹能為預(yù)測(cè)同源基因的功能提供一些依據(jù)。DAG1 (AtDof3.7) 能通過(guò)抑制GA3ox1基因,減少赤霉素含量,從而抑制種子萌發(fā);而DAG2(AtDof2.5)能促進(jìn)種子萌發(fā)[27-28],MD01G1084700、MD01G1224500、MD06G1114000、MD07G1153300、MD07G1295200、MD14G1135300與DAG1、DAG2位于A組的一個(gè)分支上,說(shuō)明它們也可能參與種子的萌發(fā)調(diào)控。擬南芥CDF1、CDF2和CDF3通過(guò)抑制CONSTANS基因轉(zhuǎn)錄來(lái)控制開花期[29-30],I組中MD00G1125100、MD06G1194500、MD13G1070600、MD14G1201600、MD16G1071400、novelG001312與上述3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子較近,它們也可能參與蘋果花期調(diào)控。B組中,MD09G1195800、MD17G1176100和ADOF1在一個(gè)分支,ADOF1在胼胝質(zhì)組織中表達(dá)量較高,ADOF1可能影響酚類化合物的合成[31]。因此,MD09G1195800和MD17G1176100也可能與該功能有關(guān)。在氧化脅迫和水楊酸誘導(dǎo)下,OBP1能調(diào)節(jié)防御基因表達(dá),OBP1還與細(xì)胞分裂周期有關(guān)[32],與其在同一分支上的MD02G1161200、MD08G1040100、MD15G1034500、MD15G1275300也可能具有類似的功能。
進(jìn)化樹分析中,位于同一分支的基因親緣關(guān)系近,而親緣關(guān)系越近[33-36],Dof基因的結(jié)構(gòu)及其編碼的氨基酸序列的motif數(shù)量和相似度越高。轉(zhuǎn)錄因子家族含有的motif 在相同的組中是高度保守的[37]。通過(guò)motif 分析,51個(gè)Dof蛋白含有15個(gè)高度保守的 motif,其中motif 1和motif 13含有CX2CX21CX2C單鋅指結(jié)構(gòu)。除MD07G1265700不含有motif 1和motif 13,MD14G1201300、MD06G1194100、MD05G1023800各含有1個(gè)motif 13,其他Dof蛋白各含有1個(gè)motif 1。表明在相同組中含有相同保守基序的Dof蛋白也許具有相似的功能。
基因表達(dá)模式能為其功能預(yù)測(cè)提供一定的參考[37-38]。OBP2在擬南芥的根和葉片中表達(dá)量最高,在莖和花中表達(dá)量低于根和葉[39],OBP2可以調(diào)控?cái)M南芥硫代葡萄糖苷的生物合成[40]。同在E組的MD04G1126500、MD12G1078400、MD03G1096400、MD07G1197500、MD11G1111100、MD01G1126700基因也是多數(shù)在根、葉中表達(dá)量較高。GO分析結(jié)果表明,它們都參與生物合成和代謝的調(diào)控,因此推斷這些基因可能參與蘋果次生代謝的調(diào)控。OBP4在擬南芥各個(gè)組織器官中均有表達(dá),并參與細(xì)胞周期和細(xì)胞擴(kuò)增的負(fù)調(diào)控[22]。同在F組的MD00G1115200、MD10G1292200、MD07G1265700、MD06G1205900、MD14G1216800基因也在各個(gè)組織均表達(dá),且多數(shù)在花中的表達(dá)量最高。說(shuō)明它們可能主要參與花中細(xì)胞周期的調(diào)控。MD01G1084700、MD07G1197500、MD08G1040100和MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表達(dá)量最高,在成熟果肉中均未被檢測(cè)到,它們可能與果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。
本研究中,除MD05G1023800基因沒有檢測(cè)到表達(dá)外,其他Dof基因的表達(dá)均對(duì)鹽堿處理有響應(yīng),只是響應(yīng)強(qiáng)度和時(shí)間有差異。在鹽堿脅迫下,顯著上調(diào)的Dof基因有7個(gè),顯著下調(diào)的有15個(gè)??傊O果大部分Dof 家族基因可能在鹽堿脅迫響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用,但它們的功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
參考文獻(xiàn):
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(責(zé)任編輯:陳海霞)