馮小艷 王俊剛 趙婷婷 彭李順 王文治 馮翠蓮 沈林波 張樹珍

摘要：【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸轉運蛋白基因（ScTDT），并分析其在甘蔗不同組織及在鋁脅迫下的表達模式，為深入研究該基因功能及抵抗鋁脅迫的分子機制提供理論依據(jù)。【方法】利用同源克隆技術從甘蔗品種ROC22中克隆ScTDT基因，利用生物信息學軟件進行序列分析，采用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在甘蔗不同組織（根、莖和葉）及在鋁脅迫（0、10和20 μmol/L Al3+）下的表達水平?！窘Y果】克隆獲得的ScTDT基因，開放閱讀框（ORF）全長1623 bp，編碼540個氨基酸殘基，蛋白相對分子量57.34 kD，理論等電點（pI）5.77，為不穩(wěn)定的疏水蛋白，可能定位于質(zhì)膜、液泡和/或高爾基體，其氨基酸序列與高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性，其中與高粱的TDT氨基酸序列相似性最高，達96.30%，說明ScTDT與高粱TDT的親緣關系最近。ScTDT基因在甘蔗根、莖和葉中均有表達，但根中表達量顯著高于莖和葉（P<0.05，下同）。在鋁脅迫處理下，3個甘蔗品種（ROC22、柳城05-136和中糖1202）的根中ScTDT基因表達量較對照組（0 μmol/L Al3+）均顯著升高，尤其是柳城05-136和中糖1202隨著營養(yǎng)液中Al3+濃度增加，ScTDT基因的表達量呈顯著升高趨勢，說明高濃度Al3+脅迫更能誘導ScTDT基因高效表達。3個甘蔗品種中，以中糖1202的ScTDT基因表達量變化最大，柳城05-136次之，以ROC22的變化最小?！窘Y論】克隆獲得的ScTDT基因表達具有組織特異性，在根中高效表達可能與甘蔗抵抗鋁脅迫相關，即植株通過上調(diào)根中ScTDT基因表達，從而加快液泡中蘋果酸的釋放，促使蘋果酸從根中分泌到土壤與Al3+反應，從而減少鋁毒害，表明ScTDT基因可能參與甘蔗抵抗鋁脅迫，且不同甘蔗品種的抗鋁脅迫能力有所不同。

關鍵詞： 甘蔗;液泡膜二羧酸轉運蛋白（TDT）;基因克隆;組織;鋁脅迫

中圖分類號： S566.106.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0325-07

Abstract：【Objective】To clone the sugarcane tonoplast dicarboxylate transporter gene（ScTDT） and analyze its expression pattern in different tissues of sugarcane and under aluminum stress， so as to provide a theoretical basis for in-depth study of the gene function and the molecular mechanism of sugarcane resistance to aluminum stress. 【Method】Homologous cloning technology was used to clone ScTDT from sugarcane variety ROC22. Bioinformatics software was used to analyze the gene sequence. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expression levels in di-fferent sugarcane tissues（root， stem and leaf） and under aluminum stress（0， 10 and 20 μmol/L Al3+）. 【Result】 The cloned ScTDT gene had an open reading frame（ORF） of 1623 bp， encoding 540 amino acid residues with a relative molecular weight of 57.34 kD and a theoretical isoelectric point （pI） of 5.77. ScTDT protein was an unstable hydrophobin and may be located in plasma membrane， vacuole and/or Golgi. The amino acid sequence of ScTDT was highly similar to the amino acid sequence of TDT in sorghum（XP_002460443.1）， rice（XP_015612609.1） and maize（PWZ04635.1）. Among them， the TDT amino acid sequence of sorghum had the highest similarity， reaching 96.30%， indicating that ScTDT had the closest genetic relationship with TDT of sorghum. The ScTDT gene was expressed in sugarcane roots， stems and leaves， and the expression level in roots was significantly higher than that in stems and leaves（P<0.05， the same below）. Under aluminum stress， the expression of ScTDT gene in the roots of the three sugarcane varieties（ROC222， Liu-cheng 05-136 and Zhongtang 1202） was significantly higher than that of the control group（0 μmol/L Al3+）， especially in Liucheng 05-136 and Zhongtang 1202. With the increase of Al3+ concentration in the nutrient solution， the expression of ScTDT gene in these two varieties showed a significant increase trend， indicating that high-concentration Al3+ stress could induce the high-efficiency expression of ScTDT gene. Among the three sugarcane varieties， Zhongtang 1202 had the lar-gest change in ScTDT gene expression， followed by Liucheng 05-136， and ROC22 had the smallest change. 【Conclusion】The cloned ScTDT gene is tissue-specific， and its high expression in roots may be related to the resistance of sugarcane to aluminum stress. That is， plants can up-regulate the expression of ScTDT gene in roots to accelerate the release of malate from vacuoles， and then promote the secretion of malate from the roots into the soil to react with Al3+， thereby reducing the toxicity of aluminum， which indicates that the ScTDT gene may be involved in sugarcane resistance to aluminum stress. Different sugarcane varieties have different resistance abilities to aluminum stress.

Key words： sugarcane; tonoplast dicarboxylate transporter（TDT）; gene cloning; tissue; aluminum stress

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD1000503）; Basal Research Fund of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630052020013）

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharum spp.）是我國最重要的糖料作物，經(jīng)提汁、清凈、蒸發(fā)、結晶、分蜜和干燥等工序制成食糖。全國約90%的食糖（王明強等，2010;?？∑娴龋?018）來源于甘蔗。蔗區(qū)土壤酸化引發(fā)的鋁毒害是目前制約我國甘蔗生產(chǎn)的主要障礙（敖俊華等，2010;盧穎林等，2016;曾巧英等，2017）。研究發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫下植物根系會分泌出蘋果酸等有機酸陰離子與土壤中的Al3+反應形成無毒害的復合物，從而保護植株不受鋁毒害（Delhaize et al.，2007;Ma，2007;Yang et al.，2013）。液泡膜二羧酸轉運蛋白（Tonoplast dicarboxylate transporter，TDT）是重要的蘋果酸轉運體，在植物抵抗鋁脅迫中發(fā)揮重要作用（Liu et al.，2017;Medeiros et al.，2017）。因此，對甘蔗TDT基因進行克隆及表達分析，對深入探究甘蔗抵抗鋁脅迫的分子機制具有重要意義。【前人研究進展】蘋果酸是植物代謝過程中的重要有機酸，不僅能為植物生長發(fā)育提供能量，還在植物抵抗鋁脅迫、調(diào)節(jié)氣孔、維持細胞質(zhì)pH及滲透壓平衡等過程中發(fā)揮重要作用（胡軍瑜等，2009;Sweetman et al.，2009;Centeno et al.，2011;Meyer et al.，2011）。TDT是一種重要的蘋果酸轉運體，在蘋果酸的積累和降解過程中發(fā)揮轉運功能。細胞中新合成的蘋果酸首先在細胞質(zhì)中積累，達一定濃度后，通過TDT和蘋果酸轉運離子通道將其運輸?shù)揭号葜袃Υ?，當細胞代謝需蘋果酸時（如鋁脅迫時），TDT再將蘋果酸從液泡中轉運出來（Hurth et al.，2005;Kovermann et al.，2007;Martinoia et al.，2007）。目前已有較多關于植物TDT及其基因的研究報道。Emmerlich等（2003）在擬南芥中鑒定到1個TDT蛋白（AtTDT），該蛋白與人類鈉/二羧酸共轉運蛋白高度同源，亞細胞定位于液泡膜上，且AtTDT基因在嫩葉中表達水平最高，其次為成熟葉片、莖和花，在根中幾乎不表達。張燕子（2010）從蘋果中克隆到1個TDT基因（MdtDT1），將其轉入TDT缺失的擬南芥突變體中進行功能互補驗證，結果顯示MdtDT1基因對缺失突變體起到功能互補和恢復的作用。巫偉峰（2017）通過同源克隆技術從李子中克隆得到1個TDT-like基因，經(jīng)基因時空表達及其與蘋果酸的關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，TDT-like基因在一定程度上正向調(diào)控蘋果酸含量高的品種中蘋果酸積累，但在蘋果酸含量低的品種中不具有調(diào)控作用。Liu等（2017）從番茄中鑒定到1個TDT蛋白（SlTDT），亞細胞定位于液泡膜上，且SlTDT基因在根、莖、葉、花和果實中均表達;過表達SlTDT基因導致番茄果實中蘋果酸含量顯著升高，檸檬酸含量顯著降低，而抑制SlTDT基因表達則獲得相反的結果，表明SlTDT基因在番茄液泡蘋果酸和檸檬酸的轉運中起重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見有關甘蔗TDT基因（ScTDT）克隆及在甘蔗不同組織中和鋁脅迫下表達模式研究的文獻報道?！緮M解決的關鍵問題】利用同源克隆技術從甘蔗中克隆ScTDT基因，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測其在甘蔗不同組織及鋁脅迫下的表達模式，為深入研究該基因功能及抵抗鋁脅迫的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

采集海南臨高的甘蔗品種ROC22的根、莖和葉用于ScTDT基因組織表達模式分析。甘蔗品種ROC22、柳城05-136和中糖1202的脫毒種苗由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所實驗室誘導、擴繁、生根并保存，用于ScTDT基因在鋁脅迫下的表達模式分析。主要試劑：EZNA Plant RNA Kit購自Omega Bio-Tek公司;RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Scientific公司;2×Taq Plus MasterMix購自Biosharp公司;FastStart Universal SYBR? Green Master（ROX）購自Roche公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自愛思進生物技術（杭州）有限公司;pMD19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司;其他生化試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：Biometra TOne PCR儀（Analytik Jena AG，德國）、CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）和核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

1. 2 鋁脅迫處理

將ROC22、柳城05-136和中糖1202的脫毒種苗置于改良的1/4 Hoagland-Arnon配方營養(yǎng)液中預培養(yǎng)15 d后，選取健康且長勢一致的幼苗，以AlCl3·6H2O為鋁源進行鋁脅迫處理：在營養(yǎng)液中分別添加適量鋁源，使Al3+濃度分別為0、10和20 μmol/L，每個處理設置3個生物學重復。脅迫處理24 h后，采集植株的根置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 基因克隆

按照EZNA Plant RNA Kit說明提取ROC22葉片的總RNA，經(jīng)RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA第一鏈。從甘蔗轉錄組數(shù)據(jù)中挖掘出與高粱TDT基因高度同源的Unigene，利用Primer Premier 5.0設計其全長克隆引物ScTDT-F：5'-ATGGATCCGCGGCGCGGCTA-3'和ScTDT-R：5'-CTATGCCATGCCAAAAACCAGAG-3'。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系50.0 μL：2×Taq Plus MasterMix 25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板 1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收后連接至pMD19-T載體，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞并挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 4 生物信息學分析

使用ExPASy的ProtParam分析ScTDT蛋白的氨基酸組成、等電點及分子量等理化性質(zhì)，使用WoLF PSORT預測其亞細胞定位。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTp查找ScTDT的同源氨基酸序列，并利用MEGA 5.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）（BootStrap為1000）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 5 表達模式分析

根據(jù)ScTDT基因全長序列，利用Primer Premier 5.0設計其RT-qPCR引物（ScTDT-Q-F：5'-CCACGCT CTGCCTCATGTAC-3'和ScTDT-Q-R：5'-CCCAGGG ATGTCGTCTGTTAG-3'）。以GADPH為內(nèi)參基因，其引物為GADPH-Q-F：5'-CACGGCCACTGGAAG CA-3'和GADPH-Q-R：5'-TCCTCAGGGTTCCTGAT GCC-3'（Iskandar et al.，2004）。以ROC22的根、莖和葉及鋁脅迫處理的ROC22、柳城05-136和中糖1202脫毒種苗的根為樣品。利用EZNA Plant RNA Kit分別提取其總RNA，經(jīng)RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA第一鏈。參照FastStart Universal SYBR? Green Master（ROX）配制RT-qPCR反應體系。擴增程序：95 ℃預變性10 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);增加溶解曲線。設置3次技術重復。利用2-△△Ct方法計算基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），最后利用SPSS 19.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 ScTDT基因克隆及序列分析結果

以ROC22葉片的cDNA為模板，PCR擴增到一條1600 bp左右的條帶（圖1），與預期結果相符?；厥赵撈芜B接至pMD19-T載體，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆進行測序，結果（圖2）顯示該片段長度為1623 bp，編碼540個氨基酸殘基。

2. 2 系統(tǒng)進化分析結果

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTp查找克隆獲得的基因編碼蛋白的同源氨基酸序列，結果發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性，分別為96.30%、88.60%和84.87%，說明ScTDT與高粱TDT的親緣關系最近（圖3），進一步證實克隆獲得的基因序列為ScTDT基因。

2. 3 生物信息學分析結果

利用ExPASy的ProtParam對ScTDT蛋白的理化性質(zhì)進行預測，結果顯示該蛋白的分子式為C2621H4154N656O718S31，相對分子量為57.34 kD，理論等電點（pI）為5.77，富含亮氨酸（占14.4%）、丙氨酸（占10.6%）和甘氨酸（占9.8%），不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，共含40個負電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）和34個正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）;該蛋白在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞的預計半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為114.54;不穩(wěn)定系數(shù)II為41.14，親水性平均值（GRAVY）為0.654，推測其是不穩(wěn)定的疏水蛋白。利用WoLF PSORT對ScTDT蛋白進行亞細胞定位，結果顯示，ScTDT蛋白可能定位于細胞質(zhì)膜、液泡和/或高爾基體。

2. 4 ScTDT基因的組織表達分析結果

由圖4可知，ScTDT基因在甘蔗的根、莖和葉中均有表達，但不同組織中的表達量存在顯著差異（P<0.05，下同），其中以根中的表達量最高，是莖的3.45倍，葉中次之，是莖的1.93倍，以莖中的表達量最低，說明ScTDT基因表達具有組織特異性。

2. 5 ScTDT基因在鋁脅迫下的表達分析結果

由圖5可知，在鋁脅迫處理下，3個甘蔗品種的根中ScTDT基因表達量較對照組（0 μmol/L Al3+）均顯著升高，尤其是柳城05-136和中糖1202隨著營養(yǎng)液中Al3+濃度增加，ScTDT基因的表達量呈顯著升高趨勢，說明高濃度Al3+脅迫更能誘導ScTDT基因高效表達。3個甘蔗品種中，以中糖1202基因的表達量變化最大，10和20 μmol/L Al3+脅迫處理下ScTDT基因的表達量分別顯著升高至對照組的5.40和10.00倍;柳城05-136次之，10和20 μmol/L Al3+脅迫處理下ScTDT基因的表達量分別顯著升高至對照組的1.95倍和2.54倍;ROC22的基因表達量變化最小，10和20 μmol/L Al3+脅迫處理下ScTDT基因的表達量分別顯著升高至對照組的1.25和1.30倍。

3 討論

植物通過根系分泌蘋果酸等有機酸陰離子與Al3+反應形成無毒害復合物以抵抗鋁脅迫（Delhaize et al.，2007;Yang et al.，2011;Chen，2012;Yang et al.，2013）。此過程分泌的蘋果酸來源于細胞質(zhì)，而細胞質(zhì)中蘋果酸含量需維持在一定水平以保證細胞的正常代謝，液泡與細胞質(zhì)間蘋果酸的快速交換是維持細胞質(zhì)蘋果酸含量的主要方式（Delhaize et al.，2007;Yang et al.，2013）。而TDT是在液泡和細胞質(zhì)間運輸蘋果酸的重要轉運體，說明其在植物抵抗鋁脅迫過程中發(fā)揮作用（Hurth et al.，2005;Martinoia et al.，2007）。本研究利用同源克隆技術從甘蔗中克隆獲得ScTDT基因，開放閱讀框（ORF）全長1623 bp，編碼540個氨基酸殘基，其氨基酸序列與高粱、水稻和玉米的TDT具有高度的相似性，為探究不同物種抵抗鋁脅迫的分子機制打下基礎。

TDT在液泡的蘋果酸和檸檬酸轉運中起重要作用（Liu et al.，2017）。Emmerlich等（2003）、Liu等（2017）通過綠色熒光蛋白瞬時表達的亞細胞定位方法分別將擬南芥AtTDT和番茄SlTDT定位于液泡膜上，表明亞細胞定位結果與蛋白功能相符。巫偉峰（2017）利用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)李子的TDT-like蛋白也定位于液泡膜上。本研究利用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)ScTDT定位于細胞質(zhì)膜、液泡和/或高爾基體，實際定位仍有待進一步試驗分析驗證。

前人研究表明，TDT基因表達具有組織特異性。如擬南芥AtTDT基因在莖、葉和花中表達，其中在嫩葉中表達量最高，其次為成熟葉片、莖和花，在根中幾乎不表達（Emmerlich et al.，2003）。番茄SlTDT基因在根、莖、葉、花和果實中均有表達，其中嫩葉中表達量最高，根和果實中表達量較低（Liu et al.，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，ScTDT基因在甘蔗的根、莖和葉中均有表達，且根中表達量顯著高于莖和葉，與AtTDT和SlTDT基因（Emmerlich et al.，2003;Liu et al.，2017）存在明顯差異，其原因可能是TDT在不同植物中的主要功能不同，如AttDT和SlTDT在嫩葉中高效表達暗示二者可能參與葉片的光合代謝（Emmerlich et al.，2003;Liu et al.，2017），而ScTDT在根中高效表達則可能與甘蔗抵抗鋁脅迫相關。

為了探究ScTDT基因在甘蔗抵抗鋁脅迫過程中的作用機制，本研究對3個甘蔗品種進行鋁脅迫處理，并分析其根中ScTDT基因的表達模式，結果顯示，3個甘蔗品種根中ScTDT基因均受鋁脅迫誘導上調(diào)表達，且高濃度Al3+脅迫更能誘導ScTDT基因高效表達，說明ScTDT基因可能在甘蔗抵抗鋁脅迫過程中發(fā)揮作用，即植株通過上調(diào)ScTDT基因表達，從而加快液泡中蘋果酸的釋放，促使蘋果酸從根中分泌到土壤中與Al3+反應，從而減少鋁毒害（Martinoia et al.，2007;Yang et al.，2013）。3個甘蔗品種在鋁脅迫下，以中糖1202的ScTDT基因表達量變化最大，柳城05-136次之，ROC22的變化最小，由此推測，3個甘蔗品種抵抗鋁脅迫的能力由高到低依次是中糖1202、柳城05-136和ROC22。但中糖1202、柳城05-136和ROC22實際抗鋁脅迫能力有待進一步田間驗證，且ScTDT基因在甘蔗抵抗鋁脅迫的具體作用機制尚不清楚，有待深入研究。

4 結論

克隆獲得ScTDT基因具有組織表達特異性，在根中高效表達可能與甘蔗抵抗鋁脅迫相關，即植株通過上調(diào)根中ScTDT基因表達，從而加快液泡中蘋果酸的釋放，促使蘋果酸從根中分泌到土壤與Al3+反應，從而減少鋁毒害，表明ScTDT基因可能參與甘蔗抵抗鋁脅迫，且不同甘蔗品種的抗鋁脅迫能力有所不同。

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（責任編輯 陳 燕）