劉珊 敬秀平 謝安衛(wèi) 尹詩

摘要 目的：觀察天王補心丹對失眠模型鼠行為學的影響，探析其對TLR4通路的影響。方法：利用氯苯丙氨酸腹腔注射制備失眠模型，將成模45只大鼠數(shù)字隨機分為模型組、天王補心丹低劑量組（7 g/kg）及天王補心丹高劑量組（28 g/kg），另設空白組15只。連續(xù)中藥干預7 d后比較各組大鼠曠場行為學、睡眠時間、中縫背核Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化蛋白88（MyD88）以及外周血清核因子-κB、誘導干擾素β的TRIF變化。結果：天王補心丹可明顯減少失眠模型大鼠中央格停留時間、修飾次數(shù)，延長睡眠時間縮短睡眠潛伏期，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），外周血核因子-κB、TRIF、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1以及中縫背核TLR4、MyD88水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：天王補心丹可改善失眠，其作用機制可能與通過TLR4通路調(diào)節(jié)機體免疫有關。

關鍵詞 失眠;模型大鼠;天王補心丹;行為學;中縫背核Toll樣受體4信號通路;關鍵因子;腫瘤壞死因子-α;白細胞介素-1

Study on the Therapeutic Effect and Partial Mechanism of Tianwang Buxin Pill on Insomnia Model Rats

LIU Shan，JING Xiuping，XIE Anwei，YIN Shi

（General Department，People′s Hospital of Guang′an City of Sichuan Province，Guang′an 638500，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Tianwang Buxin Pill on the behavior of insomnia model rats and to explore its effect on TLR4 pathway.Methods：The insomnia model was established by intraperitoneal injection of chlorophenylalanine.A total of 45 rats were randomly divided into a model group，a low dose Tianwang Buxin Pill group （7 g/kg） and a high dose Tianwang Buxin Pill group （28 g/kg）.Another 15 rats in the blank group were established.After continuous intervention with Chinese medicine for 7 days，the changes of open field behavior，sleep time，Toll-like receptor 4 （TLR4），myeloid differentiation protein 88 （MyD88） and peripheral serum nuclear factor-kappa B （NF-kappa B），TIR base domain linker molecule for inducing interferon β （TRIF） were compared in each group.Results：Tianwang Buxin Pill could significantly reduce the central lattice residence time and modification times of insomnia model rats，and prolong the sleep time and shorten the sleep latency （P<0.05）.The levels of NF-κ B，TRIF，TNF-α，IL-1 in peripheral blood and TLR4 and MyD88 in dorsal raphe nucleus decreased （P<0.05）.Conclusion：Tianwang Buxin Pill can improve insomnia，and its mechanism may be related to the regulation of immunity through TLR4 pathway.

Keywords Insomnia; Model rats; Tianwang Buxin Pill; Behavior; TLR4 signaling pathway; Key factors; TNF-α; IL-1

中圖分類號：R289.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.017

失眠是臨床常見的睡眠障礙性疾病，流行病學調(diào)查顯示我國普通人群中約45.4%存在失眠問題[1]，主要表現(xiàn)在難以入眠、醒后復睡困難或醒后精力體力無法恢復，給人們的工作、生活帶來嚴重的困擾。目前治療失眠的西藥多以苯二氮艸卓類、抗抑郁藥為主，雖可在一定程度上改善癥狀，但反彈、成癮及戒斷等嚴重不良反應影響了治療依從性。失眠屬于中醫(yī)學“不寐”的范疇，認為陽盛陰衰，陰陽失交是其主要病機，天王補心丹源自《攝生秘剖》，近年來大量臨床資料[2-4]均證實天王補心丹可有效治療不寐，但其作用機制目前尚無定論。

有文獻顯示長期失眠機體免疫功能受損，有研究人員通過基礎實驗證實失眠大鼠TLR4信號通路被過度激活[5]，TLR4表達適量時可調(diào)節(jié)機體的天然免疫系統(tǒng)，如果過度表達時可激活下游核因子-κB信號通路，最終引起細胞炎癥反應，從而干擾機體免疫系統(tǒng)。由此我們設想：天王補心丹有效治療失眠的作用機制是否通過TLR4信號通路進行介導。基于此進行動物實驗，旨在進一步研究天王補心丹治療失眠的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

70只SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g，所有大鼠均購自蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司[醫(yī)學動物合格證號：SCXK（蘇）2015-0009）]。所有大鼠均接受同批次飼料喂養(yǎng)，實驗均在每日上午8：00-11：30時間段進行，保持環(huán)境安靜、通風，溫度（26±1.5）℃，濕度（45±2）%。各組大鼠在體質(zhì)量、性別等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。具有可比性。

1.1.2 藥物

天王補心丹（華潤三九（臨清）藥業(yè)有限公司，國藥準字Z3772003）成分：生地黃120 g、五味子、當歸身、天冬、麥冬、柏子仁、酸棗仁各30 g、人參、玄參、丹參、白茯苓、遠志、桔梗各15 g。

1.1.3 試劑與儀器

核因子-κB ELISA試劑盒（江蘇江萊生物技術有限公司，批號：27382），TRIF ELISA試劑盒（江蘇江萊生物技術有限公司，批號：281723），TLR4一抗抗體（購自美國Abcam公司，貨號：ab13556），MyD88一抗抗體（美國Abcam公司，貨號：ab2064），β-actin一抗（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0061r），PCPA（購自TargetMol，貨號：T1447）。

渦旋振蕩儀（上海珂淮儀器有限公司，型號：WS-50D）;轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（購于Bio-Rad公司，型號：Trans-Blot SD）;臺式高速離心機（Eppendorf，型號：5418）。

1.2 干預方法

1.2.1 分組與模型制備

分組：70只大鼠隨機分為空白組和造模組，空白組15只，造模組60只，將60只造模組進行失眠模型制備，最終45只成模，將成模的大鼠隨機分為模型組、低劑量組及高劑量組，每組15只。

模型制備[5]：將所有動物適應性喂養(yǎng)7 d后進行模型制備，每日8：00開始造模，對造模組大鼠腹腔注射PCPA混懸液（0.4 g/kg），連續(xù)注射2 d。當動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天夜晚均活動不停時提示失眠模型制備成功。

1.2.2 給藥方法

根據(jù)人/鼠公斤體質(zhì)量的等效劑量計算方法，本研究的天王補心丹懸濁液藥量為7.5 g/kg，去藥渣合并藥液后對藥汁進行濃縮，利用婆梅氏比重計對濃縮后藥汁的濃度進行測量，使最終藥液濃度為1.06 g/mL。隨后對中藥組大鼠進行低（7 g/kg）、高劑量（28 g/kg），空白組及模型組大鼠接受1 mL生理鹽水干預。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學

于最后1 d干預結束30 min后將各組大鼠置于自制木箱內(nèi)，記錄大鼠3 min內(nèi)站立次數(shù)、停留中央網(wǎng)格的時間（t）、修飾次數(shù)以及排便顆粒。

1.2.3.2 翻正反射試驗（睡眠狀況）

根據(jù)參考文獻[5-6]所述，翻正反射消失提示進入睡眠。本實驗于最后一日干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg），記錄大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間。

1.2.3.3 用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測法測定各組外周血核因子-κB、TRIF水平變化

于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，取其腹主動脈血5 mL，高速離心后取出上清液，用相應的ELISA試劑盒對各組細胞的核因子-κB、TRIF、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1）水平進行檢測，具體步驟如下：將樣本加入ELISA反應孔板中，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，加入PBS洗滌2次，3 min/次，同時設置空白對照孔，再加入的酶標抗體，室溫下孵育1 h后加入PBS洗滌2次，3 min/次。反應結束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2 mol/L硫酸，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光值（A值）。操作過程完全按照說明書進行。

1.2.3.4 用Western Bloting測定各組中縫背核TLR4、MyD88水平變化

于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，充分麻醉后處死，取中縫背核組織200 mg加1 mL裂解緩沖液，4 ℃，15 000 r/min，離心，冰浴中超聲，20 s/次，間隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL測蛋白含量。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調(diào)為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結束后將凝膠取出，進行轉(zhuǎn)膜，按照膠在負極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時間依據(jù)各指標分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進行預染，看電泳帶是否清晰，證實蛋白質(zhì)確實轉(zhuǎn)移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入抗TLR4、MyD88、β-actin一抗抗體孵育，4 ℃過夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記與一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中反應1 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，4組數(shù)據(jù)同時符合正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用多組秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組睡眠狀況比較

在翻正反射實驗中發(fā)現(xiàn)造模大鼠睡眠時間短，睡眠潛伏期明顯延長，經(jīng)過天王補心丹干預后大鼠睡眠時間延長，睡眠潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組行為學差異

研究發(fā)現(xiàn)失眠模型制備大鼠在中央格停留時間、修飾次數(shù)以及排便量明顯增多，經(jīng)過天王補心丹干預后大鼠中央格停留時間、修飾次數(shù)、排便顆粒明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平比較

經(jīng)過ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平明顯升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)過天王補心丹干預后外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組中縫背核TLR4、MyD88水平變化

模型組大鼠中縫背TLR4、MyD88表達明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)過天王補心丹干預后中縫背TLR4、MyD88表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

3 討論

失眠屬于中醫(yī)學“不得眠”“不得寐”“目不瞑”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期即已對此病的病因病機進行探析。正如《靈樞·口問》描述：“陽氣盡，陰氣盛，則目瞑;陰氣盡而陽氣盛，則寤矣。”認為睡眠-覺醒周期取決于機體的陰陽消長平衡。至宋代醫(yī)家認為：“臥則魂歸于肝，神靜而得寐，今肝有邪，魂不得歸，是以臥則魂揚若離體也?！碧岢龈尾鼗旯δ芘c睡眠正常與否息息相關。隨著對失眠病因病機的進一步認知，清代醫(yī)家描述：“蓋日不能寐者，乃腎不交于心;夜不能寐者，乃心不交于腎也。”“陽氣自動而之靜，則寐;陰氣自靜而之動，則寤;不寐者，病在陽不交陰也?！闭J為心腎不交、陰陽失調(diào)是導致失眠的重要原因[7-10]。雖然歷代醫(yī)家對失眠的病因病機認識各有側(cè)重，但歸根結底“臟腑失衡，陽不入陰、營衛(wèi)失和”貫穿于疾病始終。天王補心丹首載于《攝生總要》，歷代醫(yī)家將其廣泛應用于失眠的治療，并取得了理想療效。該方含有生地黃、五味子、當歸身、天冬、麥冬、柏子仁、酸棗仁、人參、玄參、丹參、茯苓、遠志、桔梗。方中重用生地黃，聯(lián)合玄參共為君藥，共行使滋陰養(yǎng)血之功，以滋補肝腎之陰血為主，水盛則火得以抑制，血不燥則津自潤[11]。天冬、麥冬加強君藥滋陰之功，柏子仁、酸棗仁、當歸有養(yǎng)血養(yǎng)心安神的作用，諸藥共為臣藥，助君藥滋陰潤燥養(yǎng)心。配以人參加強益氣的作用，氣為血帥，氣充則陰血自生，此外，人參亦有養(yǎng)心安神的作用[12]。五味子有益氣滋腎，生津斂陰之功，攜人參共奏補氣生陰之功。茯苓、遠志有健脾養(yǎng)血安神益智的作用，又可交通心腎。丹參清熱活血養(yǎng)心，使諸藥補而不滯[13]。朱砂可清熱鎮(zhèn)心，安神，兼治其標。桔梗質(zhì)輕浮，性上行，為使藥可能引諸藥上行，發(fā)揮“舟楫”之用[14]。諸藥合用，共奏補益心腎、滋陰養(yǎng)血、調(diào)和陰陽的功效，與失眠中醫(yī)病機一一對應，故可針對性治療失眠。

本研究利用PCPA腹腔注射制備失眠動物模型，在成模大鼠中，通過曠場實驗及翻正反射實驗觀察到大鼠的確出現(xiàn)了在中央格停留時間、修飾次數(shù)以及排便量明顯增多，睡眠時間短，睡眠潛伏期明顯延長的睡眠障礙征象。在經(jīng)過天王補心丹干預后大鼠中央格停留時間、修飾次數(shù)和糞便顆粒數(shù)均明顯減少，睡眠指標亦明顯改善，這提示天王補心丹明顯改善了失眠模型大鼠的行為學及睡眠質(zhì)量，這一結果與國內(nèi)外臨床研究或動物研究一致[5，15-17]。有研究表明處于失眠狀態(tài)的機體淋巴細胞的表達及功能均產(chǎn)生變化，有數(shù)據(jù)顯示大鼠在接受睡眠剝奪后NK細胞數(shù)目明顯減少，在滿足大鼠的睡眠需求后NK細胞表達回歸至正常水平。也有臨床研究顯示失眠患者血漿IL-1和核因子-κB水平升高，當患者睡眠時間延長時此類現(xiàn)象被抑制。因此越來越多學者將研究失眠發(fā)生機制的視角集中于機體固有免疫應答方面[18-19]。有資料顯示失眠模型大鼠TLR4信號通路關鍵基因表達水平上升，TLR4信號通路是調(diào)節(jié)機體免疫的重要生物信號[5，20]。本研究亦證實接受失眠模型制備的大鼠外周血及腦組織的TLR4信號通路關鍵因子出現(xiàn)了過表達現(xiàn)象，且TNF-α、IL-1水平同時升高，認為失眠激活了TLR4信號通路，同時激活了機體的炎癥反應，導致TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)的表達。

因此，本研究證實天王補心丹可改善失眠，其作用機制可能是通過抑制TLR4通路關鍵因子過表達，抑制了機體的炎癥反應，調(diào)整機體的免疫功能而實現(xiàn)的。

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（2019-10-12收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81273851）

作者簡介：劉珊（1988.08—），女，碩士，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學，E-mail：sknq80@163.com